不同粗饲料来源日粮山羊冻干瘤胃液：发酵特性、微生物群落及复溶后体外发酵性能

《Frontiers in Microbiology》：Lyophilized rumen fluid from goats fed different roughage-based diets: fermentation characteristics, microbial communities, and post-reconstitution in vitro fermentation performance

　　

引言：新鲜瘤胃液是瘤胃液移植（RFT）的理想供体材料，但储存稳定性差和批次间变异性大限制了其应用。方法：本研究将饲喂苜蓿干草或玉米秸秆日粮山羊的冻干瘤胃液样品分别命名为AHP和CSP。体外发酵试验中，每个日粮组内各批次的冻干瘤胃液部分合并并复溶；添加底物的组分别命名为AH和CS，而AH-CON和CS-CON为相应的无底物对照。结果：冻干得率分别为6.29%和6.38%，可培养碳水化合物利用菌数量分别为3.79×10⁷和3.93×10⁷ CFU/g，AHP与CSP之间均无显著差异。AHP的丙酸和戊酸浓度较高（p<0.05），而CSP的乙酸和异戊酸浓度较高，且乙酸/丙酸比（A/P）较高（p<0.05）。细菌、真菌和产甲烷菌群落结构组间差异显著（p<0.01），CSP的细菌和真菌Shannon指数较高（p<0.01）。AHP显著富集细菌属Xylanibacter、Segatella、Prevotellaceae_UCG-001和Succinivibrio；真菌属Neocallimastix、Piromyces、Feramyces和Aspergillus；产甲烷菌属Methanoculleus和Methanosphaera。CSP显著富集细菌属norank_f__F082、Rikenellaceae_RC9_gut_group、norank_f__Bacteroidales_BS11_gut_group、norank_f__[Eubacterium]_coprostanoligenes_group、Ruminococcus、Monoglobus、norank_f__UCG-010和Candidatus Saccharimonas；真菌属Orpinomyces、unclassified_f__Neocallimastigaceae、Cyllamyces、Caecomyces、Pecoramyces、Anaeromyces、Joblinomyces和Alternaria；产甲烷菌属Methanobrevibacter和Methanolacinia。跨域相关性分析显示，同一粗饲料来源组内富集的属之间主要呈正相关，AHP与CSP富集属之间呈负相关。与各自无底物对照相比，AH和CS的气体产量、细菌粗蛋白（BCP）、总挥发性脂肪酸（TVFA）、乙酸、丙酸和丁酸均升高，pH降低（p<0.05）。CS的pH、乙酸、异戊酸、TVFA和A/P较高，而AH的气体产量、丁酸和戊酸较高（p<0.01）。讨论：总体而言，供体日粮粗饲料来源影响了冻干瘤胃液的发酵特性和微生物组成。复溶后，两种接种物均发酵外源底物并表现出不同的发酵特征，支持其作为可储存接种物用于RFT标准化的潜力。

研究背景与问题

反刍动物瘤胃微生物主要包括细菌、古菌、真菌和原虫，它们通过协同作用分泌纤维素酶、淀粉酶等消化酶，将植物性饲料降解为挥发性脂肪酸（VFA）、氨态氮（NH₃-N）和细菌粗蛋白（BCP）等宿主可利用代谢产物。VFA约提供反刍动物所需能量的60%–70%，并参与上皮发育、能量代谢和免疫调节；NH₃-N是瘤胃微生物蛋白合成的关键氮源，BCP则是反刍动物可利用蛋白质的重要来源。因此，调控瘤胃微生物群落是改善反刍动物瘤胃发酵功能的重要策略。

瘤胃液移植（RFT，将供体瘤胃液转移至受体以重塑瘤胃菌群的技术）已被用于调节胃肠道微生物结构、改善瘤胃功能、防治疾病、促进生长发育和提高产奶效率。然而，目前RFT主要依赖新鲜瘤胃液，其货架期短、运输困难、批次间一致性差，限制了临床应用。冻干技术可将瘤胃液转化为固态制剂，便于储存和运输，已在人粪便微生物移植（FMT）中显示出良好稳定性。供体日粮中的粗饲料来源是影响瘤胃液性质的重要因素；苜蓿干草和玉米秸秆是中国北方反刍动物生产中两种代表性粗饲料。研究人员假设冻干能够保留瘤胃液的基础微生物活性，且供体粗饲料来源会使冻干接种物形成不同的微生物群落和发酵表型。

研究内容与总体结论

研究人员选用40头健康未孕内蒙古绒山羊（38月龄，体重37.28±3.32 kg），随机分为苜蓿干草日粮组和玉米秸秆日粮组（等能等氮，精粗比50:50），每组20头。通过口腔插管采集瘤胃液，每组混合后与10%脱脂奶等体积混合，经?80°C预冻和真空冷冻干燥制备AHP和CSP。研究评估了冻干得率、可培养碳水化合物利用菌数量、发酵参数、细菌/真菌/产甲烷菌群落结构、PICRUSt2功能预测以及复溶后体外发酵性能。结果表明，粗饲料来源未显著影响冻干得率（6.29%对6.38%）和可培养菌数（3.79×10⁷对3.93×10⁷ CFU/g），但显著改变了VFA组成和三类微生物群落结构；复溶后两种接种物均能有效发酵外源底物，并保留与供体日粮相关的发酵特征，可作为RFT标准化候选可储存接种物。

关键技术与方法

供体为呼和浩特金莱绒山羊场40头健康未孕内蒙古绒山羊。瘤胃液经四层纱布过滤并组内混合，与10%脱脂奶1:1混合，?80°C预冻后真空冻干，每组6批。复溶后测定pH、NH₃-N（苯酚-次氯酸盐比色法）、VFA（气相色谱）、BCP（考马斯亮蓝法）、纤维素酶和α-淀粉酶活性。微生物分析采用16S rRNA V3–V4区、真菌ITS1区和产甲烷菌mcrA基因Illumina NextSeq 2000测序，经QIIME2/DADA2处理，分别以SILVA、UNITE、FunGene数据库注释；通过LEfSe、Spearman相关、PICRUSt2进行差异和功能预测。体外发酵采用Menke与Steingass人工唾液，添加1 g底物，39°C厌氧培养24 h，ANKOM AGRS自动记录产气量。

研究结果

3.1 冻干得率、可培养菌数和发酵特性

AHP与CSP的冻干得率、可培养碳水化合物利用菌数量、pH、NH₃-N、BCP、总VFA、丁酸、异丁酸、纤维素酶和α-淀粉酶均无显著差异。AHP的丙酸和戊酸浓度显著较高，CSP的乙酸和异戊酸浓度显著较高，且CSP的乙酸/丙酸比（A/P）显著高于AHP。

3.2 微生物群落特征

3.2.1 微生物α多样性和β多样性

基于Bray–Curtis距离的主坐标分析（PCoA）显示，AHP与CSP的细菌、真菌和产甲烷菌群落均明显分离（ANOSIM，p<0.01）。Chao指数组间无显著差异；CSP的细菌和真菌Shannon指数显著高于AHP，产甲烷菌Shannon指数无显著差异。

3.2.2 细菌群落组成

细菌群落以Bacteroidota和Bacillota为优势门。AHP显著富集Succinivibrio、Xylanibacter、Segatella和Prevotellaceae_UCG-001；CSP显著富集norank_f__F082、Rikenellaceae_RC9_gut_group、Ruminococcus、Monoglobus、norank_f__[Eubacterium]_coprostanoligenes_group等属。Spearman相关分析显示，A/P与丙酸、戊酸相关细菌呈相反趋势，与乙酸相关细菌呈正相关。

3.2.3 真菌群落组成

真菌群落以Neocallimastigomycota为优势门。AHP显著富集Neocallimastix、Piromyces、Feramyces和Aspergillus；CSP显著富集Orpinomyces、unclassified_f__Neocallimastigaceae、Cyllamyces、Caecomyces、Pecoramyces、Anaeromyces、Joblinomyces和Alternaria。相关分析表明，AHP富集真菌与丙酸、戊酸正相关，与A/P负相关；CSP富集真菌多与乙酸、A/P正相关。

3.2.4 产甲烷菌群落组成

产甲烷菌以Euryarchaeota为优势门，Methanobrevibacter和Methanoculleus为主要属。AHP显著富集Methanoculleus和Methanosphaera；CSP显著富集Methanobrevibacter和Methanolacinia。Methanoculleus与丙酸正相关，Methanobrevibacter与纤维素酶活性和A/P正相关。

3.2.5 细菌、真菌和产甲烷菌群落间相关

同一粗饲料来源组内富集的细菌、真菌和产甲烷菌属之间主要呈显著正相关；AHP与CSP富集属之间则主要呈显著负相关，提示不同粗饲料来源形成不同的跨域微生物关联模式。

3.2.6 PICRUSt2细菌功能预测

两组Level 1代谢功能均以Metabolism为主。AHP在淀粉和蔗糖代谢、果糖和甘露糖代谢、半乳糖代谢、氨基糖和核苷酸糖代谢等碳水化合物代谢通路相对丰度较高；CSP在丙酮酸代谢、柠檬酸循环、丙酸代谢、丁酸代谢以及缬氨酸/亮氨酸/异亮氨酸降解等氨基酸代谢通路相对丰度较高。

3.3 复溶后体外发酵性能

与各自无底物对照相比，AH和CS的气体产量、BCP、TVFA、乙酸、丙酸和丁酸均显著升高，pH显著降低。AH的气体产量、丁酸和戊酸显著高于CS；CS的pH、乙酸、异戊酸、TVFA和A/P显著高于AH。两组NH₃-N无显著差异。

讨论总结

总体而言，供体日粮粗饲料来源通过改变瘤胃微生物群落结构，进而影响冻干瘤胃液的发酵表型。苜蓿干草来源的冻干瘤胃液富集与可溶性碳水化合物、果胶和植物多糖降解产物利用相关的细菌、真菌和产甲烷菌，与丙酸和戊酸较高的发酵特征一致；玉米秸秆来源的冻干瘤胃液富集结构碳水化合物降解相关类群及多种厌氧真菌，与乙酸主导、A/P较高和细菌/真菌Shannon指数较高的特征一致。复溶后两种接种物均保留了基础代谢活性，能够利用外源底物，其发酵差异与供体日粮背景基本一致。研究人员也指出局限性：未设置新鲜瘤胃液对照，无法定量评估冻干复溶后功能的保留程度；气体产量持续监测但pH和代谢物仅在终点测定；未进行体内移植验证；冻干制剂未直接筛查特定病原体，未来需对每批制剂进行布鲁氏菌、口蹄疫病毒等病原检测。

结论译文

本研究证明，供体日粮粗饲料来源不显著影响冻干得率和可培养碳水化合物利用菌数量，但显著改变冻干瘤胃液的细菌、真菌和产甲烷菌群落结构；不同粗饲料来源还对应不同的跨域微生物关联模式，并与发酵表型差异一致。基于苜蓿干草的冻干瘤胃液丙酸和戊酸浓度较高，其微生物群落富集与可溶性碳水化合物、果胶和植物多糖降解产物利用相关的类群；基于玉米秸秆的冻干瘤胃液乙酸和异戊酸浓度较高，A/P较高，细菌和真菌Shannon指数较高，其微生物群落富集与结构碳水化合物降解相关的类群。复溶后，两种制剂在体外发酵中均能有效利用外源底物，并表现出与各自供体日粮基本一致的发酵模式。总体而言，冻干瘤胃液可作为一种易于储存的接种物，具有用于RFT标准化的潜力；这些发现为评估和优化调节反刍动物瘤胃微生物生态的RFT策略提供了基础。