水相中大环与笼状主体对核苷酸的仿生分子识别研究进展

《Chemical Society Reviews》：Biomimetic molecular recognition of nucleotides by macrocyclic and cage hosts in waterOpen Access

　　

核苷酸在生物学中是至关重要的分子，充当DNA和RNA的结构单元、能量载体以及信号分子，并作为支持关键代谢和催化过程的辅酶发挥作用。本教程综述聚焦于合成受体（特别是大环和笼状结构）的开发，这些受体能够选择性地结合核苷酸。研究这些系统有助于科学家更深入地理解生物学中的分子识别原理，并推动诸如监测细胞内核苷酸水平等技术。本综述强调了受体设计领域的最新进展，探讨了其结构、结合机制以及影响选择性的因素（如形状、构象和化学相互作用）。论文还涵盖了实验技术和应用，重点阐述了理解非共价相互作用如何为新型功能材料、催化剂和药物的开发提供信息。关键学习要点包括：（1）核苷酸的关键结构和理化性质，包括核碱基官能团、糖构象和磷酸基团电荷，决定了它们被合成受体识别的过程；（2）大环和笼状受体由明确的构建模块（如芳香单元、氢键基序和阳离子基团）构建而成，这些模块能够实现高效结合；（3）亲和力和选择性源于非共价相互作用的协同效应，包括静电作用、氢键和π-π堆积；（4）合成受体利用多种可并行作用的传感机制；（5）受体设计的进展已推动其在传感、成像、诊断和药物发现中的应用。

1. 引言

核苷酸在生物系统中发挥着关键作用，是DNA复制、能量代谢（如ATP利用）和信号转导等基础过程的基石。DNA核苷酸（A、T、G、C）是编码遗传信息的双螺旋合成的基础，而RNA核苷酸（A、U、G、C）则支持蛋白质合成的转录和翻译。ATP作为能量来源，为生物合成、转运和肌肉收缩等过程供能。GTP和UTP在代谢和细胞运动中也支持类似的耗能反应。核苷酸还作为第二信使，例如cAMP和cGMP在激素响应和酶调控途径中传递信号。此外，许多核苷酸被用作辅酶，如NAD⁺、FAD和CoA，它们对氧化还原反应、脂肪酸代谢及其他催化过程至关重要。

从生物化学角度来看，能够选择性结合特定核苷酸或识别核酸序列中核碱基的合成主体，可以极大地加深研究人员对生命系统中识别原理和机制的理解。此外，通过成像技术在线监测核苷酸浓度变化，可为细胞过程和对外界刺激的生物响应提供有价值的信息。本教程综述收集了过去7年中关于核苷酸大环受体的文献，介绍了设计概念的系统化、主要结构基序的分析以及传感机制的描述。论文讨论了影响核苷酸强结合或特异性结合的参数，如主体和客体的构象、形状及酸碱平衡。文献实例按照从简单到复杂的系统进行组织，并根据设计中使用的结构元素进行排列。所选主体表现出的强亲和力、选择性或新开发的结合机制为未来设计提供了宝贵的见解。尽管近年来出现了一些基于金属的核苷酸受体实例，但本综述仅考虑了金属笼，其中金属位点的主要作用是形成大环结构并提供正电荷。理解多种非共价相互作用的协同作用、结合贡献和热力学，不仅对设计主体至关重要，也对其功能化自组装结构、新型催化剂、合成转运体以及二维和三维材料的设计具有重要意义。

2. 天然识别原理

对结合或利用核苷酸的酶及其相应晶体结构的文献分析表明，自然界采用了多种重复策略来实现特异性结合。例如，ATP结合蛋白利用与氨基酸残基（称为“精氨酸手指”或“赖氨酸手指”）的γ-磷酸接触来实现选择性分子识别。另一种策略是空腔尺寸和形状，其对ATP几何形状的匹配度远高于ADP。有趣的是，酶对ATP与ADP的选择性（Kd比）并非特别高，范围约为5至20。GTP酶中也观察到类似的选择性范围。核碱基配对在DNA复制、转录和遗传信息传递中起基础作用。阳离子分子笼具有明确限定的疏水空腔，可作为水介质中识别和封装核碱基对的有效人工受体。

3. 核苷酸及其性质

核苷酸由三个基本组分构成：含氮碱基（嘌呤和嘧啶）、五碳糖环（核糖或脱氧核糖）以及一至三个磷酸基团。核苷酸的酸碱行为主要由杂环核碱基决定，而磷酸基团在生理pH下基本去质子化。核苷酸表现出独特的氧化还原特性，使其能够通过光诱导电子转移（PET）作为许多经典荧光染料的有效、序列依赖性猝灭剂。核碱基的紫外光吸收特性使其能够发生光化学反应，最著名的是紫外线照射下DNA中嘧啶的二聚化。金属离子通过磷酸骨架和N7等供体位点与核苷酸强烈相互作用，其中Mg²⁺是最重要的生物核苷酸结合离子。

4. 阳离子大环（CMs）和阳离子笼（CCs）

带有共价连接环状骨架和正电荷中心（如咪唑鎓、吡啶鎓、三唑鎓）的CMs和CCs在核苷酸识别方面表现出明显优势。其阳离子部分确保了良好的水溶性，与核苷酸的生理环境匹配，并能与核苷酸形成多种非共价相互作用，增强结合亲和力和选择性。CMs和CCs的主要合成挑战在于产率中等以及分离纯化繁琐。采用高稀释条件和基于尺寸匹配原理的合理设计可提高反应选择性和产率。

4.1. 吡啶鎓类CMs和CCs

吡啶作为含氮六元芳香杂环，具有独特的亲核反应活性，可通过S_N2反应形成吡啶鎓阳离子，是构建CMs和CCs的理想模块。遵循尺寸匹配原则，可通过吡啶取代化合物与苄基溴取代化合物的一步化学计量反应轻松合成具有单空腔的二维大环（如1-6）。其中受体1对ATP表现出高识别选择性，结合常数高达10⁴ M^-1，主要受静电作用和π-π堆积相互作用控制。基于四苯乙烯（TPE）单元的P/M旋转构象，TPE基CMs可通过手性核苷酸诱导产生适应性手性响应。研究人员进一步开发了具有更大空腔体积和更多活性识别位点的三维笼状结构（如15-18）。笼15能有效封装两当量脱氧核苷酸并稳定其氢键二聚化，同时手性客体通过主客体相互作用诱导其产生适应性手性。笼16因其更紧凑的空腔结构，可通过疏水和静电相互作用在水溶液中包封两个核苷酸分子，并对GMP/GTP表现出选择性荧光关闭和CD开启响应。三柱笼17对NADH和NAD⁺表现出不同的识别行为。笼18可封装两个U型FAD分子，其TPE部分表现出过量的M螺旋构象和正的Cotton CD效应。基于三苯胺的吡啶鎓笼19能高效包封ATP，结合常数高达5.37 × 10⁵ M^-1，并伴随明显的客体诱导荧光增强和圆偏振发光（CPL）。异面笼20由四吡啶基修饰的TPE核与四吡啶基功能化的卟啉反应构建而成，可与NADH结合并实现优越的光催化NADH氧化。

4.2. 咪唑鎓类CMs和CCs

咪唑鎓阳离子具有多种结合机制、可调选择性、丰富响应性和广泛识别场景适应性等特点。咪唑鎓阳离子的酸性C2–H质子可与阴离子形成（C–H）⁺?X^?离子氢键，这是识别的重要驱动力。Ma等人合成的非荧光大环21和荧光大环22-23在核苷酸识别中表现出磷酸基团数量对结合亲和力的显著影响。Cao等人设计合成了由苯或蒽连接的TPE基咪唑鎓大环24和25，其中24对GTP表现出显著的荧光增强，而25则通过蒽单元间的π-π相互作用形成激基缔合物，荧光响应强度顺序为ATP > CTP > UTP > GTP。蒽基咪唑鎓大环26对NTPs表现出两个层次的适应性手性响应，并通过结构互变产生相反的圆二色（CD）响应和具有显著CPL性质的组装手性。通过逐步法合成了具有三维结构的杯30和笼31-32，其中杯30能以2:1的结合比协同包封一个NADH分子或包封两个ATP分子。笼31能包封两个NTP分子，并在其疏水空腔内稳定匹配和不匹配的核碱基对，其晶体结构证实了Watson-Crick G:G*互变异构碱基对的形成。

4.3. (1,2,3-三唑鎓)类CMs和CCs

1,2,3-三唑鎓作为1,2,3-三唑的N-烷基化衍生物，表现出显著增强的氢键供体能力和π酸性。Kim等人通过逐步点击反应合成了系列1,2,3-三唑大环，再经N-烷基化得到三唑鎓大环，对AMP表现出选择性识别。Yoon等人利用三唑鎓笼35和36结合荧光指示剂置换分析（FIDA），实现了对ATP的选择性荧光响应，结合常数分别达到1.28 × 10⁷ M^-1和5.84 × 10⁶ M^-1，能在缓冲液和人血清基质中进行纳摩尔级ATP定量检测。

5. 胺基大环

近年来，一系列新型胺基大环被开发用于核苷酸识别和传感。蒽衍生环蕃是核苷三磷酸的重要合成受体类别。在pH 6.2的水性缓冲液中，大环37-39与核苷三磷酸和焦磷酸形成明确的1:1复合物。基于芘的环蕃40-43表现出两种可能构象之间的明显平衡，其中大环40对ATP响应最强。氮杂环蕃44包含萘二甲酰亚胺和芘两种不同荧光团，优先结合ATP和CTP。萘二甲酰亚胺大环家族45-51能够在水介质中结合核苷磷酸，其中受体50和51对CTP表现出显著荧光增强和增强的选择性。Davis等人开发的水溶性双蒽基四内酰胺52对生物源杂环表现出强结合，对次黄嘌呤的亲和力达到10⁷ M^-1。Kataev团队设计的萘二甲酰亚胺基大环53和54中，受体54a对环鸟苷单磷酸（cGMP）表现出强选择性结合，是首个报道的cGMP合成受体。将吡啶交换为吡啶鎓后，甲基吡啶鎓衍生物55在ATP结合中表现最佳（K₁₁ = 6.3 × 10⁴ M^-1），并能监测HeLa细胞中的ATP水平变化。Badji?课题组设计的双层笼59通过氢键和π-π堆积协同作用包封两个ATP分子，对ATP相对于ADP表现出近两个数量级的显著选择性。含有苯乙烯基吡啶和烷基胺连接基的环蕃60表现出pH依赖的荧光和核苷酸结合性质。环蕃61-63的结构与上述化合物相似，其中邻位取代环蕃61对核苷三磷酸表现出最高亲和力。杯[4]芳烃衍生物66-68也显示出有效的核苷酸识别能力，其中67与ATP的结合常数达到4.7 × 10⁸ M^-1。含有脲结合位点的大环受体69能同时以协同方式结合两个核苷酸。

6. 金属笼

阳离子金属-有机笼已成为水中阴离子生物分子的有效主体。四面体金属笼71带有Zn²⁺中心，可选择性地包封含磷酸盐的客体，包括核苷酸。Pd₂L₄笼72和73能够识别核苷三磷酸，其中Pd₂(PHP)₄笼73对阴离子NTPs表现出强亲和力，并通过手性转移诱导独特的CD信号。四面体金属-有机笼Fe(II)₄L₄（74）可作用于单链DNA、错配DNA碱基对、三向DNA连接和G-四链体（G4）结构，并保护DNA免受核酸酶切割。含苯并咪唑的Pd₂L₄笼75作为四向连接（4WJs）的高选择性结合剂，利用外部芳香表面匹配DNA连接的几何形状。通过设计更小的复合物76，可以完全改变3WJ和4WJ之间的选择性。

7. 传感机制

荧光方法因其高灵敏度、多种信号模式（如猝灭、增强、寿命变化、FRET、CPL）和强时空分辨率而被广泛用于核苷酸检测。根据文献分析，上述超分子体系中的荧光核苷酸传感主要源于分析物诱导的激发态失活或激活途径的调节，传感机制可分为七组：（1）光诱导电子转移（PET）——最常见的是含鸟嘌呤核苷酸引起的荧光猝灭；（2）F?rster共振能量转移（FRET）——大环受体中两个不同染料的例子很少，这是一个未来目标；（3）激基缔合物形成——核苷酸结合中和正电荷，允许自组装并出现激基缔合物发射带；（4）分子内旋转限制（RIR）——结合诱导的刚性化抑制非辐射衰减，增强荧光；（5）聚集诱导发射（AIE）——TPE基四咪唑鎓环蕃在水中自组装成纳米球，ATP结合产生更大的纳米球并降低zeta电位；（6）指示剂置换分析（IDA）——利用带负电的染料与主体结合，核苷酸置换染料导致荧光恢复；（7）适应性手性——通过非共价主客体相互作用将手性转移至原本非手性或弱手性的超分子框架，产生可测量的手性光学信号。

8. 生物应用

大环受体通过选择性核苷酸识别和响应性构象行为实现多种生物应用。大环15和31可在仿生条件下稳定和监测核碱基对。大环19和40结合ATP、ADP和AMP后产生不同的手性或荧光响应，可实现ATP水解酶（己糖激酶和腺苷三磷酸双磷酸酶）或ATP合成酶（肌酸激酶）催化过程和活性的实时监测。大环55对ATP表现出选择性靶向和荧光开启响应，可动态监测HeLa细胞内的ATP水平。在生物催化应用中，大环6与NAD⁺形成的超分子人工辅因子6?(NAD⁺)₂体系与醇脱氢酶配合，可实现可见光驱动的生物活性手性分子不对称合成。在治疗应用中，大环受体50能在细胞内以序列特异性方式选择性结合富含胞嘧啶的RNA，对卵巢癌细胞产生微摩尔级毒性。阳离子笼18?uFAD₂复合物作为超分子光敏剂，在低氧肿瘤中显示出显著的治疗效果。异面笼20通过破坏癌细胞内的NADH氧化还原平衡实现光动力治疗。

9. 结论与展望

大环和笼状主体因其限定的疏水空腔、多个均匀分布的非共价相互作用位点和模块化结构，在核苷酸识别方面具有独特优势。尽管已取得显著进展，但仍存在许多挑战：受体设计中亲水性和生物相容性的平衡；开发包含高量子产率荧光染料（最好是两种不同染料）的主体以实现比率传感；在复杂生物环境中实现特定核苷酸的高选择性；预测和控制受体在细胞内的亚细胞定位；靶向疾病相关核苷酸组装体（如G-四链体和错配碱基对）；实现序列特异性DNA/RNA识别；以及通过小分子调控DNA组装。大环主体有望在疾病诊断、靶向治疗和核酸分析领域推动技术创新。