《Digital Discovery》：CyclicMPNN: stable cyclic peptide sequence generationOpen Access
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环肽是一类具有前景的治疗药物，因其具备增强的结构稳定性、细胞通透性以及抵抗蛋白水解降解的能力等优良药物特性。随着CyclicCAE和RFPeptide等环肽骨架生成模型的最新进展，与传统基于算法或物理的方法相比，生成环肽骨架的速度已显著提升。然而，仅使用标准氨
环肽是一类具有前景的治疗药物，因其具备增强的结构稳定性、细胞通透性以及抵抗蛋白水解降解的能力等优良药物特性。随着CyclicCAE和RFPeptide等环肽骨架生成模型的最新进展，与传统基于算法或物理的方法相比，生成环肽骨架的速度已显著提升。然而，仅使用标准氨基酸来设计能量上有利且适配所生成骨架的环肽序列仍非易事。研究人员对当前最先进的蛋白质序列设计深度学习模型ProteinMPNN进行了微调，使用的数据集由来自蛋白质数据库（Protein Data Bank，PDB）的实验测定溶液核磁共振（NMR）环肽结构以及计算机模拟（in silico）生成的环肽组合而成。该研究方法在环肽序列设计方面超越了ProteinMPNN，能够生成能量上稳定的序列，且折叠成目标环肽骨架的成功率更高。研究人员证明CyclicMPNN可用作模体修复（motif-inpainting）策略以及从头序列设计（de novo sequence design）任务。研究人员认为CyclicMPNN将实现能量稳定环肽序列的快速设计，从而提高治疗性环肽开发的成功率。
**论文解读：CyclicMPNN——面向环肽序列设计的深度学习方法**
**一、研究背景与科学问题**
环肽（cyclic peptide）是一类具有重要治疗潜力的分子，因其与线性肽相比具备显著增强的结构稳定性、细胞通透性以及抵抗蛋白水解降解的能力，近年来受到学术界和工业界的广泛关注。环肽可通过固相肽合成（solid-phase peptide synthesis）和噬菌体展示文库（phage display library）等方法进行化学合成，这些合成策略使得对环肽的化学性质进行调控以改善其稳定性、亲和力、特异性和通透性成为可能。
在计算设计领域，环肽的设计传统上主要依赖基于物理的方法，如Rosetta分子建模套件和分子动力学（Molecular Dynamics，MD）模拟。在Rosetta框架中，可通过多种方法基于氨基酸拉氏图（Ramachandran plot）偏好对给定肽序列进行骨架采样以生成结构系综；在MD中，则常采用偏置交换变构动力学（bias-exchange metadynamics，BE-META）或副本交换分子动力学（replica exchange molecular dynamics，REMD）等增强采样技术进行构象采样。然而，这些方法往往计算成本高昂。
近年来，用于蛋白质序列设计的深度学习模型取得了突破性进展，其中最具代表性的是ProteinMPNN。尽管ProteinMPNN并未在肽或环肽上进行显式训练，但已有研究将其与迭代设计和Rosetta弛豫相结合用于生成稳定的环肽。然而，该工作流程通常需要多轮设计和结构精修，效率有待提升。因此，开发一个权重专用于环肽的ProteinMPNN模型以提升效率和性能具有重要的科学价值和应用意义。
**二、研究内容与意义**
研究人员提出了CyclicMPNN，一个专为环肽序列设计而微调的ProteinMPNN变体。微调数据集由蛋白质数据库（PDB）中的实验测定结构以及计算机模拟生成的环肽骨架混合构成。计算机模拟数据集利用广义运动学闭环（Generalized Kinematic loop Closure，GenKIC）方法生成环状聚丙氨酸骨架系综，随后使用ProteinMPNN为这些骨架分配序列，再利用改进的AlphaFold模型HighFold进行折叠预测，该模型通过修改偏移矩阵将线性位置编码替换为相对位置编码。
CyclicMPNN在多项评估中展现出优越性能：在从头环肽骨架的结构重建精度（以RMSD衡量）和预测局部距离差异检验（predicted Local Distance Difference Test，pLDDT）评分方面均优于ProteinMPNN和HighMPNN；CyclicMPNN设计的序列还展现出更高的序列多样性和更低的重复性；对于实验测定的环肽晶体结构，CyclicMPNN在单轮序列设计中即可实现更低的预测RMSD；在模体修复任务中，CyclicMPNN生成的含有目标模体的稳定环肽数量约为ProteinMPNN的两倍。
研究人员认为CyclicMPNN代表了环肽序列设计的前沿方法，为高通量环肽工程提供了实用工具，其影响力可与ProteinMPNN对蛋白质设计领域的贡献相类比。更广泛地，该研究所采用的数据集生成和微调策略为将预训练蛋白质设计模型扩展到代表性不足的结构体系及其他专门化设计任务提供了通用框架。
**三、关键技术方法概述**
研究使用了GenKIC方法（Rosetta套件中基于机器人学启发的运动学方法）生成不同长度（6、8、10个氨基酸残基）的环状聚丙氨酸骨架系综，并通过骨架间氢键过滤。序列由ProteinMPNN生成，结构预测采用HighFold。微调数据集包含上述计算机模拟生成的序列-骨架对以及80个来自PDB的溶液NMR实验测定环肽结构（大小范围为4至39个残基）。数据集使用MMseqs2以30%序列同一性进行聚类，划分训练集、验证集和测试集。微调从预训练ProteinMPNN权重初始化，使用HyperMPNN重训练管线，所有参数均可训练，训练在单个NVIDIA A100 GPU上进行约两小时，基于验证困惑度（validation perplexity）选择第164轮模型。从头设计评估分别使用GenKIC生成10,000个骨架和RFPeptide生成100个14聚体骨架。MD模拟使用GROMACS软件配合CHARMM36力场，在300 K和1 bar条件下运行50 ns三重复轨迹。稳定性评估使用PNear指标，通过simple_cycpep_predict方法生成构象系综并计算漏斗样度量。
**四、主要研究结果**
**（一）CyclicMPNN能生成重现X射线晶体结构的新序列**
研究人员以Rettie等人（2025）发表的四个环肽晶体结构（PDB编号：9CDT、9HGC、9CDU、9HGD）为测试案例，对CyclicMPNN、ProteinMPNN和HighMPNN进行基准测试。结果显示，CyclicMPNN在结构重建精度（RMSD）和序列独特性方面均优于两个基线模型：ProteinMPNN的最低RMSD序列的序列恢复率（sequence recovery）波动较大（44%至86%），而CyclicMPNN的序列恢复率更为一致（40%至57%），且所有设计序列均实现高精度结构重建（RMSD ≤ 1.0 ?）。MD模拟表明，CyclicMPNN和ProteinMPNN设计的序列在50 ns三重复轨迹中表现出相似的稳定性，而HighMPNN序列则与晶体结构差异显著且有时不稳定。
**（二）CyclicMPNN为从头结构设计出优于ProteinMPNN的序列**
在6、8、10聚体的GenKIC骨架数据集（各10,000个结构）上，CyclicMPNN设计的序列在RMSD和pLDDT方面均优于ProteinMPNN，结构重现性的相对改善率分别为16.23%、20.60%和9.23%。对RMSD ≤ 0.5 ?的6聚体子集的分析显示，CyclicMPNN序列的中位PNear值（0.6）显著高于ProteinMPNN（0.08）。在RFPeptide生成的14聚体骨架上，CyclicMPNN同样取得了更低的RMSD和更高的pLDDT，相对改善率分别为22.78%和42.85%。MD模拟结果总体上支持了上述发现，8聚体和10聚体中CyclicMPNN的RMSD均值更低。
**（三）从指定模体开始的序列生成表现优异**
研究人员以Nrf2中与Keap1结合的热点环区（hot loop）序列EETG为模体，使用CyclicCAE采样了100个含有该模体的8残基环肽骨架。在条件生成（仅设计非模体残基）和无条件生成（重新设计完整序列）两种设置下，CyclicMPNN均产生了整体PNear值更高的序列。PNear ≥ 0.6的优异序列几乎全部来自CyclicMPNN。CyclicMPNN产生的稳定肽数量是ProteinMPNN的两倍（12个对比6个），并且序列重复率更低。
**（四）序列空间探索分析**
通过进化尺度建模（Evolutionary Scale Modeling，ESM）嵌入和统一流形逼近与投影（Uniform Manifold Approximation and Projection，UMAP）降维分析发现，对于6聚体和8聚体，CyclicMPNN生成的序列在投影嵌入空间中占据的区域比ProteinMPNN更广泛；对于10聚体，两种方法采样了相似的序列空间区域。这表明CyclicMPNN在保持与目标结构兼容的前提下，探索了序列空间中未被ProteinMPNN充分覆盖的邻近区域。
**五、讨论与结论**
在讨论部分，研究人员指出CyclicMPNN尽管主要基于计算机模拟结构进行训练，但能准确重现实验测定的溶液NMR结构，生成折叠成与天然骨架高度匹配构象的序列，同时还能采样到与已知序列截然不同但结构兼容的替代序列。在从头序列设计领域，CyclicMPNN在6至14个残基的所有测试长度上均优于ProteinMPNN。研究人员同时指出了若干局限性：训练和评估所用的计算机模拟数据集仅包含头对尾环化的骨架，未显式建模二硫键连接的、内酰胺连接的、侧链对侧链的或双环肽等替代环化化学类型；所有序列均由ProteinMPNN生成，可能继承了其固有偏差；模型可能局限于预测肽的静态状态，而非其在溶液中的动态构象系综。
研究结论为：该工作证明了利用精心构建的计算机模拟数据集可以显著改善环肽设计方法；更宽泛地说，该微调框架为将大型预训练蛋白质设计模型适配到代表性不足的设计任务提供了通用策略，有望推动其他类型的受限生物分子体系的专用设计工具的开发。
