处理vinasse中微藻培养：对细胞形态与生长速率的影响

《Frontiers in Industrial Microbiology》：Growing microalgae in treated vinasse: effects on cell morphology and growth rate

　　

vinasse是乙醇工业产生的一种富含有机质和营养物的副产品，具有培养微藻的潜力。尽管其使用通常因需要稀释而受到限制，但适当的vinasse预处理可提高其作为培养基的适用性，使微藻能够良好生长。本研究调查了在100%预先处理的vinasse中培养微藻的可行性，并评估了以vinasse培养物作为连续培养循环接种物的效果。方法：在初步筛选试验中评估了九种微藻对全浓度处理vinasse的耐受性。选择其中三种——Chlorolobion braunii、Tetradesmus sp.和Haematococcus pluvialis，在6孔板（12 mL培养物）中进行进一步试验。评估了生长速率、细胞体积以及接种物来源（vinasse与合成培养基）的影响。此外，在微藻生长前后，采用核磁共振波谱（NMR）对vinasse进行表征。结果与讨论：C. braunii在全浓度处理vinasse中表现最佳，达到最高生长速率（1.3 d^?1），而Tetradesmus sp.为0.66 d^?1，H. pluvialis为0.68 d^?1。值得注意的是，C. braunii是唯一在vinasse中生长速率高于其对照的物种，提示其具有混合营养生长。混合效应模型显示，与对照相比，vinasse培养的C. braunii细胞体积增加1.6倍（208 μm³），Tetradesmus sp.增加6.3倍（250 μm³），而H. pluvialis细胞体积保持不变（5575 μm³）。当接种物来自vinasse时，与各自对照相比，C. braunii生长速率降低3.2倍（0.4 d^?1），细胞变大；但Tetradesmus sp.培养物未观察到生长响应变化（生长速率0.67 d^?1；细胞体积增大13.2倍），而H. pluvialis形成小型包囊。NMR结果显示，醋酸盐和丁酸盐被微生物联合体消耗。此外，vinasse中培养的H. pluvialis释放顺式乌头酸，该化合物与应激条件下的生理调节有关。结论：本研究通过证明在适当物种选择下，全浓度处理vinasse可作为微藻的可行培养基，推进了乙醇工业中的循环经济理念。

全球人口已超过80亿，对食品、能源和工业产品的需求持续增长，同时加剧了自然资源和环境压力。甘蔗vinasse是乙醇工业产生的大宗农业工业废弃物，产量巨大，富含有机物和无机营养物，但直接用于农田灌溉可能导致土壤盐渍化、酸化、微生物组和结构改变，并增加水体富营养化风险。微藻具有光合固碳和积累工业有用生物分子的能力，部分种类还能利用溶解态有机物进行混合营养（mixotrophy）生长，因此vinasse被视为具有潜力的微藻培养基。然而，既往研究大多依赖稀释vinasse或将其作为合成培养基的补充，vinasse浓度通常仅为5%–50%；对100%浓度处理vinasse的微藻培养鲜有探索，特别是关于连续培养循环中接种物来源的影响以及vinasse中有机物在微藻培养前后的变化仍不清楚。基于这些知识空白，研究人员提出三个问题：微藻能否在100% vinasse中培养？微藻生长如何影响vinasse组成？vinasse能否支持连续培养的接种物制备？

本研究表明，全浓度处理vinasse可支持特定微藻物种生长，C. braunii生长速率高于对照，提示其混合营养能力；Tetradesmus sp.在连续接种中表现稳定；H. pluvialis则表现出胁迫响应（包囊形成及代谢物释放）。该结果推进了乙醇工业循环经济概念，即通过适当物种选择，处理vinasse可作为微藻培养的可行介质，同时实现废弃物资源化。

研究人员采用了以下主要技术方法：vinasse来自巴西Usina Santa Lucia，经巴西专利INPI BR 102015024100-3所述方法（依次经粗砂、蒙脱石黏土和活性炭过滤）处理并调节至pH 7；微藻菌株来自巴西圣卡洛斯联邦大学淡水微藻培养库（CCMA）、藻类生物技术实验室及西班牙塞维利亚大学。研究先以96孔微板对9株微藻进行50%–100% vinasse耐受性筛选，基于生长表现选出C. braunii、Tetradesmus sp.和H. pluvialis，再于6孔板中采用100%处理vinasse培养，设对照组（BG11）、vinasse接种菌株来自BG11（V1）和vinasse接种菌株来自100%处理vinasse（V2）三种处理。生长速率通过细胞计数线性回归计算，细胞体积使用ImageJ软件按几何模型估算，vinasse培养前后的有机组成通过核磁共振波谱（NMR）表征，数据统计采用双因素方差分析和混合效应模型。

### 微藻生长速率

通过96孔筛选和6孔板生长曲线测定，C. braunii在V1处理中生长速率最高（1.3 d^?1），约为其对照（0.7 d^?1）的1.8倍，是唯一在vinasse中生长速率高于对照的物种，表明其利用vinasse中溶解性有机碳进行混合营养生长。Tetradesmus sp.和H. pluvialis在vinasse中的生长速率约为各自对照的一半（对照分别为1.3 d^?1和1.5 d^?1）。当使用vinasse培养物作为接种物（V2）时，C. braunii生长速率降至0.4 d^?1，比V1降低约1.6倍；Tetradesmus sp.的V1和V2生长速率相近（0.66 vs. 0.67 d^?1），表现出不受接种物来源影响的稳定性；H. pluvialis则在V2中形成包囊，显示强烈应激反应。

### 微藻细胞体积

通过显微测量和混合效应模型分析，vinasse培养导致细胞体积显著变化。与对照相比，V1中C. braunii细胞体积增加1.6倍（208 μm³），Tetradesmus sp.增加6.3倍（250 μm³），而H. pluvialis细胞体积维持不变（5575 μm³）。在V2（接种物源自vinasse）中，C. braunii和Tetradesmus sp.的细胞体积进一步增大，分别达1073 μm³和855 μm³，而H. pluvialis细胞体积未增大并形成包囊。细胞体积增大与生长速率降低相伴随，提示vinasse中某些成分可能对细胞分裂产生抑制。

### NMR分析

利用¹H NMR对vinasse培养前后的代谢物进行表征。处理vinasse中检测到乙醇、醋酸盐、丁酸盐、1,3-丙二醇、琥珀酸盐、甲醇、异柠檬酸等。微藻培养后，醋酸盐和丁酸盐信号强度显著降低，表明其被微生物联合体消耗，可能作为混合营养的碳源。C. braunii和Tetradesmus sp.培养后琥珀酸和异柠檬酸消失，而H. pluvialis培养后仍存在异柠檬酸，且唯一检测到顺式乌头酸（trans-aconitate的顺式异构体）的出现。顺式乌头酸是三羧酸循环的中间代谢物，其外排与细胞应激适应相关，与H. pluvialis生长速率降低和包囊形成一致。

讨论部分指出，vinasse预处理（物理过滤与化学调节）是使微藻能在全浓度下生长的关键步骤。该处理降低了浊度、调节pH至接近中性，从而保证光穿透和适宜的生长条件。C. braunii的混合营养生长体现了其对vinasse中有机碳的利用；Tetradesmus sp.对接种物来源不敏感，具有工业应用潜力；H. pluvialis受胁迫，可能是由于vinasse中有机碳谱不匹配其偏好碳源，或存在毒性物质。NMR结果进一步表明，不同微藻对vinasse中有机物的消耗和转化存在种属特异性。

研究结论可翻译为：全浓度处理甘蔗vinasse成功支持了微藻生长，但表现因物种而异。C. braunii在该废液中表现最佳，其次是Tetradesmus sp.，再次是H. pluvialis。仅C. braunii在vinasse中生长速率高于对照，表现出混合营养特性；而Tetradesmus sp.无论接种物来自vinasse还是合成培养基，保持相近生长速率，不受接种来源影响。Chlorophyta类群的C. braunii和Tetradesmus sp.在vinasse中细胞体积增加，且暴露时间越长细胞越大（通过连续接种观察）。相比之下，vinasse培养的H. pluvialis细胞体积与对照相近或更小，并且是唯一在vinasse中产生顺式乌头酸的物种，结合其降低的生长速率，表明细胞正经历应激。因此，该研究提出预处理vinasse是微藻培养成功的关键步骤，同时需要谨慎选择物种。未来工作应关注放大培养体积，以评估生物量和生物分子生产力。