《Frontiers in Microbiology》：Microbial diversity of camel milk production environments in Xinjiang, China: a full-length 16S rRNA survey of farm environmental matrices across Altay and Hami regions
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引言： 中国新疆的骆驼奶生产主要以粗放型牧区系统为主，然而与生产相关的关键环境基质的分类学及功能特征仍未得到充分表征。
方法： 本研究采用PacBio单分子实时（SMRT）全长16S rRNA基因测序技术，对来自新疆阿勒泰与哈密地区骆驼养殖场的五
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引言： 中国新疆的骆驼奶生产主要以粗放型牧区系统为主，然而与生产相关的关键环境基质的分类学及功能特征仍未得到充分表征。
方法： 本研究采用PacBio单分子实时（SMRT）全长16S rRNA基因测序技术，对来自新疆阿勒泰与哈密地区骆驼养殖场的五种环境基质（垫料、粪便、乳头皮肤、饲料和土壤）中的微生物群落进行了表征。
结果： 在去除叶绿体和线粒体序列后，所有样本中的优势菌门为厚壁菌门（Firmicutes，43.20%）、变形菌门（Proteobacteria，20.12%）和放线菌门（Actinobacteriota，12.02%）。Alpha多样性分析显示，阿勒泰地区粪便和饲料微生物群落的丰富度显著高于哈密地区（Padj < 0.05）。Beta多样性分析（PCoA、NMDS、PERMANOVA）证实了两个地区之间存在显著不同的分类学特征，其差异由地区效应和样本类型效应共同驱动。功能预测表明，各地区间代谢潜能高度保守，与氨基酸转运和能量转换相关的通路显著富集。
讨论： 本研究为新疆骆驼养殖场环境微生物组建立了基础基线，可为针对性卫生干预措施及未来探究环境因素对生驼乳品质影响的研究提供参考。本研究的一个关键局限性在于未包含生乳样本，因此无法直接推断微生物向乳中的传播途径。
论文解读文章
一、研究背景与科学问题
骆驼奶生产在新疆地区主要依托粗放或半粗放的牧区养殖体系，泌乳骆驼通常饲养于开放式圈栏中，垫料为天然秸秆或原生牧草，饲料以当地苜蓿和原生牧草为主。挤奶作业每日两次在开放式挤奶厅进行，挤奶前乳头消毒措施极为有限，这是小规模养殖体系的普遍做法。在缺乏严格卫生干预的条件下，生乳微生物群落的构成很大程度上取决于生产环境中各类微生物储库的输入。直接接触型储库包括乳头顶端表皮和乳头孔，间接接触型储库则涵盖圈栏垫料、饲槽、挤奶厅周边土壤等，而粪便因自由放牧行为成为环境接种的主要来源。这些环境基质具有迥异的理化性质：乳头皮肤是嗜温且富含脂质的界面，垫料和土壤的含水量与有机质含量波动较大，饲料则源于植物且纤维素含量高。理解不同栖息地特异性的微生物生态，对于优化骆驼养殖体系的卫生实践至关重要。
已有研究表明，在小型反刍动物中，栖息地特异性微生物群（如乳头皮肤、垫料）是生乳分类学组成的主要决定因素，区域生物地理学可解释乳微生物组结构32%的变异。然而，骆驼奶生产环境中的微生物多样性长期缺乏系统表征。传统培养依赖方法存在显著局限，而基于单分子实时（SMRT）测序的全长16S rRNA基因扩增子测序技术，可绕过培养瓶颈，实现物种水平的精确分类学解析。基于此，研究人员针对新疆阿勒泰与哈密两个骆驼养殖核心区域，系统调查了与骆驼奶生产相关的五种环境基质（粪便、垫料、饲料、乳头皮肤和土壤）的微生物群落结构，旨在阐明这些关键环境储库的分类学与功能特征，为卫生管理、疾病预防及潜在有益微生物资源挖掘提供理论基础，并为后续结合生乳样本验证微生物传播途径奠定基线。
二、研究设计与技术方法
本研究于2023年夏季（7月至9月）在新疆阿勒泰地区（3个养殖场）和哈密市（3个养殖场）共6个商业骆驼养殖场开展采样。每种样本类型在每个地区设置3个独立生物学重复（每个养殖场采集1份样本），共获得30份样本。样本类型包括：垫料（每场3个独立圈栏表层5 cm）、饲料（饲槽中新鲜粗饲料）、粪便（无菌刮刀直肠采集）、土壤（挤奶厅周边5 m范围内表层5 cm）以及乳头皮肤拭子（无菌聚酯拭子蘸取无菌磷酸盐缓冲液采集乳头孔周围2 cm2区域）。所有动物采样均在常规挤奶前乳头清洁之前完成。样本于采集后4小时内冷链运抵实验室，-80 °C保存至DNA提取。
关键技术流程包括：采用TIANamp细菌DNA提取试剂盒提取基因组DNA；以27F/1492R条形码引物扩增全长16S rRNA基因（V1-V9区）；构建SMRTbell文库后于PacBio Sequel II平台进行单分子实时（SMRT）测序。生物信息学分析流程为：ccs v6.4.0生成HiFi reads，cutadapt v4.4进行质控与引物去除，VSEARCH v2.23.0基于SILVA 138参考数据库去除嵌合体，QIIME2（v2023.2）平台q2-dada2插件进行去噪并生成扩增子序列变异（ASV），q2-feature-classifier朴素贝叶斯分类器完成分类学注释。叶绿体和线粒体序列经SILVA 138注释后从下游生态学分析中剔除，但单独报告其相对丰度作为样本组成的描述性指标。所有样本以5,000 reads统一深度进行稀疏化，过滤后保留1,247个高质量ASV。Alpha多样性（Chao1、ACE、Shannon、逆Simpson）与Beta多样性（Bray-Curtis相异度）均基于QIIME2原生插件计算；PERMANOVA以养殖场ID作为随机区组因子限制排列。
三、研究结果
3.1 整体微生物组分析
经过去除叶绿体和线粒体序列后，全部样本共鉴定出35个细菌门和100个属。优势菌门为厚壁菌门（Firmicutes，43.20%）、变形菌门（Proteobacteria，20.12%）和放线菌门（Actinobacteriota，12.02%）。未过滤的饲料样本中叶绿体序列（54.47%）和线粒体序列（17.08%）占比极高，反映了植物源饲料的固有组成特征，这些细胞器来源序列已从后续所有生态学分析中排除。
3.2 基于Alpha和Beta分析的微生物多样性
双因素方差分析（Tukey事后校正）显示，阿勒泰地区粪便样本的ACE指数（332.33 ± 30.15）显著高于哈密地区（239.07 ± 6.61；Padj = 0.012），Chao1指数也呈现相同趋势（327.47 ± 31.62 vs. 235.50 ± 5.88；Padj = 0.008）。阿勒泰饲料样本的ACE指数（348.24 ± 44.89）同样显著高于哈密（294.00 ± 17.09；Padj = 0.041）。土壤丰富度无显著地区差异。Shannon和逆Simpson指数在多数样本类型间无显著地区差异。Beta多样性分析方面，PCoA和NMDS（stress = 0.094）均显示阿勒泰与哈密两组间明显分离，ANOSIM证实组间差异显著大于组内差异（R = 0.7503，p = 0.001）。因子化PERMANOVA显示地区（Pseudo-F = 18.72，p = 0.001）、样本类型（Pseudo-F = 32.45，p = 0.001）及其交互作用（Pseudo-F = 4.12，p = 0.003）均显著解释群落结构变异，且betadisper检验确认组间离散度无显著差异，排除了方差异质性对PERMANOVA结果的干扰。属水平热图聚类显示两地区间微生物组成存在显著差异。厌氧菌属（Clostridium sensu stricto、Romboutsia、Paeniclostridium）在两地区土壤和粪便中广泛分布；Bacillus仅在阿勒泰的粪便、土壤和垫料中检出；Salinimicrobium、Flavobacterium和Halomonas为阿勒泰土壤和垫料所独有；哈密地区则富集Christensenellaceae R-7 group和Rikenellaceae RC9 group等类群。
3.3 细菌组成的共性与差异分析
五种环境基质呈现各自独特的优势类群特征。粪便样本以Romboutsia（10.77%）、Paeniclostridium（8.10%）和Jeotgalicoccus（4.85%）为主；乳头皮肤样本以Achromobacter spp.（22.23%）、Moraxella（6.29%）和Clostridium sensu stricto（5.00%）为优势属；饲料样本在过滤数据集中以Planococcaceae科成员（3.63%）为特征；土壤样本主要由Planococcaceae（7.05%）、Clostridium sensu stricto（4.16%）和Romboutsia ilealis（2.95%）构成；垫料样本则由Corynebacterium maris（5.98%）、Jeotgalicoccus spp.（5.61%）和Salinicoccus spp.（4.62%）主导。LEfSe生物标志物分析（LDA阈值4.0）显示，阿勒泰粪便和乳头皮肤样本以厚壁菌门（Firmicutes）为优势菌门，而哈密对应样本以放线菌门（Actinobacteriota）为主；土壤样本中阿勒泰以放线菌门占优、哈密以厚壁菌门占优；垫料样本同样呈现阿勒泰放线菌门主导、哈密厚壁菌门主导的格局。共鉴定出10个LDA评分超过4.0的细菌门，凸显了两地区间显著的分类学特征差异。
3.4 模型预测与功能预测
基于直系同源基因组簇（COG）数据库的功能预测显示，绝大多数基因注释到代谢功能，包括全局概览图谱和次级代谢物生物合成。主要富集通路涵盖氨基酸转运与代谢、无机离子转运与代谢，以及能量产生与转化、翻译、核糖体结构与生物发生等相关通路。两地区间COG功能谱高度一致，表明尽管分类学组成存在差异，微生物群落的核心代谢潜能具有保守性。
四、讨论与结论
本研究所识别的优势菌门组成与巴氏杀菌乳研究报道的谱型存在差异，但直接比较受限于样本类型（环境vs.乳）、动物物种、地理来源和测序方法等多重因素。与驴乳研究相比，Bacteroidota丰度（约10%）趋势一致；但与马乳中厚壁菌门占比96%的报道不同，骆驼奶环境样本的优势菌门分布更为均衡。环境溯源分析显示，阿勒泰地区厚壁菌门在乳头皮肤（49.58%）和土壤（48.65%）中高丰度存在，提示这些基质可能是与乳品质相关类群的潜在储库；哈密地区粪便样本中蓝藻门（Cyanobacteria，68.34%）和厚壁菌门（29.07%）丰度较高，其中蓝藻信号很可能代表植物源叶绿体序列而非游离蓝藻。功能预测表明微生物组高度偏向代谢活动，两地区功能谱的一致性提示生态系统内存在功能冗余。检测到乳品环境中已知的嗜冷菌类群（如Pseudomonas、Bacillus）提示潜在的腐败相关酶产生风险，但本研究未测定活菌计数、酶活性或腐败表型，无法确证功能相关性。
研究结论：本研究系统绘制了新疆阿勒泰和哈密地区骆驼奶生产相关的五种关键环境基质的微生物景观，表征了这些环境储库的分类学结构并评估了其对生乳安全与加工稳定性的潜在影响。观察到的地区间分类学组成差异与保守的功能谱，为骆驼乳制品体系的环境监测提供了基线。然而，由于未直接分析生乳样本，关于微生物向乳中传播的结论仍属初步推断，有待未来配对样本研究验证。这些发现为改进骆驼乳制品生产体系的卫生规程与质量监测提供了科学基础。
