大白菜根肿病侵染期间酵母单杂交筛选鉴定BrAGPS1启动子相关候选因子

《Frontiers in Plant Science》：Candidate promoter-associated factors of BrAGPS1 identified by yeast one-hybrid screening in Chinese cabbage during Plasmodiophora brassicae infection

　　

根肿病由专性活体营养原生生物芸薹根肿菌（Plasmodiophora brassicae）引起，严重限制大白菜（Brassica rapa subsp. pekinensis）的生产。侵染伴随宿主碳代谢的广泛重编程以及膨大根中淀粉的积累。ADP-葡萄糖焦磷酸化酶（ADP-glucose pyrophosphorylase, AGPase）催化淀粉生物合成的第一个限速步骤，但大白菜小亚基基因BrAGPS1的上游调控仍知之甚少。研究人员从自交系‘Chiifu-401-42’中克隆了BrAGPS1a（BraA07g007740.3.5C）和BrAGPS1b（BraA01g014740.3.5C）的启动子区域。PlantCARE分析预测了核心启动子基序以及与激素、胁迫和光响应相关的推定顺式调控元件。以接种后1、3和5周（weeks post-inoculation, wpi）制备的根部cDNA文库为材料，使用所选启动子片段作为诱饵进行酵母单杂交（yeast one-hybrid, Y1H）筛选，以回收候选启动子相关蛋白。筛选获得76个非冗余文库命中序列，其中15个被注释为具有潜在转录、DNA结合、组蛋白结合或染色质相关功能的蛋白质。与1、2、3和5 wpi时间点的RNA测序（RNA-sequencing, RNA-seq）数据整合分析，鉴定出28个Y1H来源基因在至少一个时间点差异表达。基于功能注释和侵染响应表达，筛选出5个候选基因——一个钙依赖性蛋白激酶（calcium-dependent protein kinase, CPK）、一个碱性亮氨酸拉链（basic leucine zipper, bZIP）转录因子、一个三高迁移率族蛋白盒（three-high-mobility-group-box, 3×HMG-box）蛋白以及两个Alfin1样植物同源结构域（plant-homeodomain, PHD-domain）蛋白。实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR, qRT-PCR）确认了不同的处理和时间依赖性表达模式，但未测试DNA结合或调控功能。本研究提供了BrAGPS1启动子相关候选因子的优先级列表，以及研究根肿病发育过程中淀粉代谢转录调控的可检验假说。需要一对一Y1H回测、凝胶迁移率变动分析、启动子反式激活测试和遗传分析来确证直接结合、调控方向和生物学功能。

论文解读

一、研究背景与意义

根肿病是由芸薹根肿菌（Plasmodiophora brassicae）引起的全球性土传病害，严重威胁十字花科作物的生产。该病害于20世纪20年代初首次在中国台湾和福建报道，自20世纪50年代以来逐步在全国蔓延。近年来，随着十字花科作物种植的集约化和区域扩展，根肿病已延伸至中国北部和西部内陆地区。几乎所有栽培十字花科作物，包括大白菜、萝卜、油菜和甘蓝，均易感P. brassicae。由于中国是全球十字花科蔬菜的主要生产国，根肿病的快速传播和持续存在对蔬菜生产和粮食安全构成严重威胁。

P. brassicae的休眠孢子可在土壤中存活多年并耐受不利环境条件，使根肿病极难防治。侵染诱导根组织异常增殖并在主根和侧根上形成大小不一的根肿。这些根肿作为强养分库，消耗大量同化物，同时损害根部水分和养分吸收。根肿病发育伴随广泛的代谢重编程，包括受侵染根组织中显著的淀粉积累。这种积累与根肿发育持续相关，但储存的碳是否直接有利于病原体、代表宿主响应还是反映库代谢改变，仍不明确。因此，阐明宿主淀粉生物合成基因的调控，对于理解受侵染根的代谢状态具有重要意义。

淀粉是源组织中光合作用的主要终产物，也是库器官中的关键碳储备。淀粉合成的直接前体是ADP-葡萄糖（ADPG），由葡萄糖-1-磷酸和ATP经ADP-葡萄糖焦磷酸化酶（AGPase）催化产生，该反应构成淀粉生物合成的第一个限速步骤。在Brassica物种中，全基因组分析已鉴定出B. rapa中有8个AGPase编码基因，包括AGPS1的同源基因。研究人员前期工作证明，P. brassicae接种后大白菜根中BrAGPS基因显著上调，表明AGPase介导的淀粉合成在根肿病侵染过程中被主动重编程。然而，BrAGPS1的上游转录调控机制仍不清楚，这成为开展本研究的主要动机。

二、研究内容与主要技术方法

本研究以大白菜自交系‘Chiifu-401-42’为材料，采用P. brassicae分离株Pb4进行茎基部注射接种。研究主要采用了以下几项关键技术方法：

第一，启动子克隆与顺式元件分析。从Brassica rapa Chiifu v3.5基因组组装中定位BrAGPS1a和BrAGPS1b基因模型，从Brassicaceae数据库（BRAD）获取推定2,000 nt上游启动子序列，利用PlantCARE进行顺式调控元件预测分析。

第二，酵母cDNA文库构建。分别提取1、3和5 wpi受侵染根的总RNA，等量混合后经Gateway BP重组构建初级文库，再经LR重组转入pGADT7载体获得次级文库，经滴度和插入片段验证确保文库质量。

第三，酵母单杂交（Y1H）文库筛选。将启动子片段克隆至pAbAi诱饵载体，线性化后整合至Y1HGold酵母菌株基因组，通过自激活检测确定最低金担子素A（AbA）抑制浓度，随后进行大规模文库筛选，对阳性克隆进行菌落PCR和Sanger测序。

第四，RNA-seq转录组分析。收集1、2、3和5 wpi的根样本，每个处理和时点设3个生物学重复，共24个RNA-seq文库，在Illumina NovaSeq 6000平台进行150 bp双端测序，用HISAT2比对至参考基因组，DESeq2进行差异表达分析。

第五，qRT-PCR验证。对优先候选基因设计特异性引物，以BrActin为内参基因，采用2^-ΔΔCt方法计算相对表达量。

三、研究结果

3.1 酵母cDNA文库构建

接种P. brassicae后，1 wpi未见明显根肿，3和5 wpi可见明显根肿，确认侵染成功。提取的总RNA完整性良好，25S:18S比值约为2:1。初级文库滴度为2.60 × 10⁶ CFU·mL^-1，总容量为1.04 × 10⁷ CFU；次级文库滴度为3.00 × 10⁶ CFU·mL^-1，总容量为1.20 × 10⁷ CFU。两个文库的重组效率均为100%，插入片段大多大于1,000 bp，表明文库质量高、容量大，可支持后续Y1H筛选。

3.2 启动子基序分析、片段克隆与诱饵载体构建

PlantCARE分析预测了BrAGPS1a和BrAGPS1b启动子中多个激素、胁迫和光响应基序，包括ABRE、G-box、MYB、MYC和光响应元件。BrAGPS1a被分为4个片段（P1–P4），BrAGPS1b被分为3个片段（P1–P3），成功克隆至pAbAi诱饵载体。

3.3 Y1HGold诱饵酵母菌株构建、自激活检测与文库筛选

6个诱饵菌株中，5个菌株在100 ng·mL^-1 AbA浓度下完全无自激活，而pAbAi-BrAGPS1a-2菌株需400 ng·mL^-1 AbA才能抑制自激活。选择pAbAi-BrAGPS1a-4和pAbAi-BrAGPS1b-1进行大规模文库筛选，分别获得1,100和480个菌落，转化效率约为1.2 × 10⁶和5.3 × 10⁵ CFU·μg^-1 DNA。测序去重后共获得76个非冗余序列。

3.4 候选蛋白功能注释与分类

76个非冗余序列中，15个被注释为具有转录、DNA结合、组蛋白结合或染色质相关功能潜力，包括1个bZIP蛋白、1个3×HMG-box蛋白、2个Alfin1样PHD结构域蛋白和11个具有锌指、组蛋白结合或染色质相关结构域的蛋白。其余61个包括信号蛋白、转运蛋白、代谢酶、结构蛋白和分子伴侣。28个Y1H来源基因在至少一个时间点差异表达，其中1个基因在全部4个时间点均差异表达，5 wpi时点特异性差异表达基因数量最多（9个）。

基于功能注释和侵染响应表达，优先筛选出5个候选基因进行qRT-PCR验证：钙依赖性蛋白激酶（BraA07g018250.3.5C）、bZIP转录因子（BraA10g004640.3.5C）、3×HMG-box蛋白（BraA01g014550.3.5C）以及两个Alfin1样PHD结构域蛋白（BraA06g041170.3.5C和BraA09g061130.3.5C）。qRT-PCR结果显示，BrAGPS1a在1 wpi出现早期瞬时升高，BrAGPS1b在1和3 wpi升高但5 wpi与对照无显著差异。5个候选基因表现出不同的时间表达模式：BraA09g061130.3.5C和BraA01g014550.3.5C在1 wpi转录本丰度较低，BraA07g018250.3.5C在3 wpi转录本丰度较低，BraA01g014550.3.5C在5 wpi转录本丰度较高，BraA10g004640.3.5C在5 wpi转录本丰度较低，BraA06g041170.3.5C在所有检测时点均与对照无显著差异。

四、讨论与结论

讨论部分指出，大多数根肿病研究集中于免疫受体和经典防御途径，而侵染相关碳分配的转录调控研究较少。本研究聚焦于BrAGPS1，提名了上游候选调控因子。预测的顺式元件包括与脱落酸、厌氧、低温、赤霉素、水杨酸、茉莉酸甲酯、光以及MYB/MYC家族因子相关的序列，这些预测为后续功能验证提供了假说。Y1H文库筛选容易产生自激活和假阳性，因此非经典命中需要一对一回测和正交验证。差异表达基因的数量和身份在侵染时间进程中变化，反映了宿主细胞类型和病原体发育阶段的混合，不能单独区分宿主防御、病原体操纵或组织组成变化。5个优先候选基因的回收和侵染响应表达提供了两个独立的候选水平证据，但均不能确证因果调控关系。研究存在以下局限性：文库Y1H结果仅为候选水平，需要一对一Y1H回测、凝胶迁移率变动分析和启动子反式激活实验验证直接结合和调控方向；仅对大小无法区分的PCR产物中一个强代表进行测序可能漏检相似长度的不同插入片段；候选功能基于注释和表达推断，需要遗传扰动实验测试对BrAGPS1表达、淀粉积累和病原体表现的影响；整体根RNA-seq无法区分细胞类型组成与细胞内调控；研究仅使用一个感病基因型，需要在抗感和感病背景下验证。

研究结论为：对BrAGPS1a和BrAGPS1b上游区域的分析、Y1H文库筛选和时间表达谱分析产生了76个非冗余候选启动子相关蛋白。其中15个具有转录、DNA结合、组蛋白结合或染色质相关功能注释，28个Y1H来源基因在至少一个侵染时间点差异表达。基于注释和表达响应性优先筛选出5个候选基因用于后续研究。qRT-PCR记录了不同的时间表达模式，但未验证结合或调控功能。因此，本研究提供了假说和实验靶标；需要直接结合、反式激活、遗传和病原体响应实验才能得出BrAGPS1调控机制或抗性作用的结论。