《Journal of Materials Chemistry B》：Influence of the lipid thioether modification and formulation method on lipoplex structure, stability and transfection efficiency in HEK293T cellsOpen Access
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脂质体复合物（lipoplex）是由核酸与阳离子脂质通过静电相互作用形成的复合体，在非病毒基因递送中需保护所携带货物、促进细胞摄取并推动胞内释放。尽管传统上通过批量复合（bulk complexation）制备，目前已有可规模化的微流控方法。然而，脂质化学与制
脂质体复合物（lipoplex）是由核酸与阳离子脂质通过静电相互作用形成的复合体，在非病毒基因递送中需保护所携带货物、促进细胞摄取并推动胞内释放。尽管传统上通过批量复合（bulk complexation）制备，目前已有可规模化的微流控方法。然而，脂质化学与制备方法如何共同影响理化性质及生物学性能仍知之甚少。为弥补这一空白，研究人员比较了两种结构匹配、仅疏水链存在差异的阳离子脂质：含两条硫醚官能化链的BSV107-S，以及含两条单不饱和链的BSV107。每种脂质分别通过两种方式制备：一是将DNA与经薄膜水化法预先形成的脂质体复合，二是通过微流控组装一步完成DNA/脂质复合。研究人员假设硫醚的引入可增加膜流动性并增强胞内质粒释放。两种脂质均形成纳米级脂质复合体，在R ≥ 2时，微流控制备的水动力学直径范围为70–100 nm，批量制备的为100–140 nm。低温透射电镜（Cryo-TEM）与小角X射线散射（SAXS）揭示多层状结构，其中BSV107-S微流控脂质复合体的层间距大于BSV107或批量制备体系。在HEK293T细胞中，转染效率取决于脂质组成与制备方法的相互作用，BSV107-S无论采用何种制备方法均持续优于BSV107。这一性能提升与FRAP测得的膜流动性增加相关，支持硫醚基团在调节膜动力学中的作用。综上，这些结果建立了连接脂质化学结构、制备方法、理化性质与生物学性能之间的结构–制备–性质关系，为更高效的非病毒基因递送系统的合理设计提供了见解。
非病毒基因递送系统在基因表达与基因替代治疗领域具有重要应用前景。与传统药物不同，这类系统可通过递送并表达治疗性遗传物质诱导持续性生物学效应。然而，其临床转化关键依赖于能够保护质粒DNA（pDNA）等核酸免于降解、确保有效细胞摄取并促进靶位点胞内释放的递送系统的开发。脂质复合体（lipoplex）作为阳离子脂质与核酸经静电自组装形成的纳米复合体，其制备可采用两种方法：一是通过薄膜水化法预先形成阳离子脂质体，再与核酸进行批量复合；二是通过微流控混合实现一步式DNA/脂质组装。尽管微流控技术在规模化、重现性和粒径均一性方面具有优势，但脂质化学结构微妙修饰与制备路径如何共同决定脂质复合体的理化性质和生物学性能，仍是该领域尚未解决的核心挑战。为此，研究人员对两种结构相关的磷酰胺阳离子脂质——含硫醚基团的BSV107-S与含双不饱和疏水尾链的BSV107——进行了系统比较。这两种脂质具有相同的连接基团和极性头基，仅在疏水尾链中是否存在硫醚基团上存在差异，从而可分离硫醚修饰对脂质复合体性能的特定贡献。
研究人员通过薄膜水化法和微流控两种互补途径制备了不同电荷比（R = [N?]/[P?]，1–5）的脂质复合体，并采用动态光散射（DLS）、电泳光散射（ELS）、低温透射电镜（Cryo-TEM）和小角X射线散射（SAXS）系统表征了粒径、粒度分布、ζ-电位及形貌结构。在模拟体外转染条件（PBS、培养基及血清）下，通过DLS和凝胶电泳评估了脂质复合体的稳定性。在HEK293T细胞中通过荧光显微镜和流式细胞术评价了转染效率和细胞摄取，并通过检测ATP相对含量评估细胞活力。
研究结果显示，两种脂质均能形成纳米级脂质复合体。微流控方法制备的脂质复合体在R ≥ 2时水动力学直径为70–100 nm，而批量复合制备的为100–140 nm。凝胶电泳表明，对于微流控样品，R = 1时仍存在弱质粒条带，R = 2时仍有拖尾，R > 2时质粒完全复合。批量复合样品在R = 0.86时可见弱条带，BSV107-S在R = 1.4时仍存在拖尾，表明其质粒压缩能力略弱。ζ-电位测量显示，R = 1时表面电荷为负值，随电荷比增加转为正值并达到+40至+60 mV，表明质粒完全复合且阳离子脂质过量富集于表面。两种脂质之间ζ-电位无显著差异，表明表面电荷主要取决于总阳离子脂质含量。SAXS和Cryo-TEM分析揭示了多层状（lamellar）内部结构，BSV107-S脂质体的双层厚度（5.00 nm）大于BSV107（4.12 nm），这归因于硫醚键引起的链构象差异。BSV107-S微流控脂质复合体的重复单元间距（6.7 nm）大于BSV107（5.9 nm）或批量制备体系。在生物学介质中的稳定性研究表明，R = 1的脂质复合体在PBS和培养基中发生尺寸增大并释放质粒，稳定性较差；而R = 4时，所有体系均未检测到质粒释放，表现出良好的胶体稳定性。BSV107-S脂质复合体在PBS中尺寸增加更明显，表明其内部稳定性略低，这可能与其较高的膜流动性相关。
在HEK293T细胞转染实验中，所有脂质复合体在24小时即可检测到GFP表达，48小时表达进一步增强。转染效率随电荷比增加而升高，在R = 4或5时达到最大值。BSV107-S脂质复合体在所有制备条件下均优于BSV107，其中BSV107-S批量复合在R = 4时获得最高转染效率（51.6% GFP?细胞）。FRAP测量证实BSV107-S巨单层囊泡（GUV）的侧向扩散系数（~2.8 μm2 s?1）显著高于BSV107（~2.3 μm2 s?1），验证了硫醚修饰增强膜流动性的假设。质粒内化动力学研究采用Cy5标记质粒进行追踪，发现BSV107和BSV107-S脂质复合体在1小时内即有超过80%的细胞呈Cy5阳性，2小时内接近100%，而Lipofectamine 3000的摄取速度明显较慢。尽管几乎所有细胞均内化了脂质复合体，GFP?细胞比例始终低于45%，表明内化并非转染效率的限制因素。四象限分析进一步显示，大量Cy5高表达细胞并未表达GFP，而BSV107-S脂质复合体在相似内化水平下实现了显著更高的GFP表达，提示其具有更高效的内体逃逸和胞内质粒释放能力。细胞活力测定表明，大多数脂质复合体在24小时未显著影响ATP水平，48小时导致约10–20%的细胞数量减少。
本研究建立了脂质化学结构、制备方法、理化性质与生物学性能之间的关联。硫醚修饰通过增大硫原子半径和C–S–C键角（175.6°）引入的链弯曲，增强了脂质膜流动性，这有利于细胞内质粒释放。制备方法主要决定粒径大小——微流控产生更小且更均一的颗粒，而批量复合产生较大的脂质复合体但转染效率更高。最佳转染效率取决于结构完整性与胞内加工效率之间的平衡，BSV107-S批量复合脂质复合体因兼具较高膜流动性和适宜的胶体稳定性而表现最优。这些发现为合理设计更高效的非病毒基因递送系统提供了重要指导。
