《Plant Biotechnology Journal》：Multiplex FAD2/FATB Editing Generates Ultra-High-Oleic, Low-Saturate Soybean With Increased Seed Fatty Acid Content
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油酸（18:1）、饱和脂肪酸（SFA）和多不饱和脂肪酸（PUFA）水平是影响油脂储藏稳定性和食用品质的重要指标。在本研究中，研究人员旨在利用CRISPR/Cas9技术同时靶向大豆（Glycine max）的脂肪酸去饱和酶2（FAD2）和脂酰基载体蛋白硫酯酶
油酸（18:1）、饱和脂肪酸（SFA）和多不饱和脂肪酸（PUFA）水平是影响油脂储藏稳定性和食用品质的重要指标。在本研究中，研究人员旨在利用CRISPR/Cas9技术同时靶向大豆（Glycine max）的脂肪酸去饱和酶2（FAD2）和脂酰基载体蛋白硫酯酶B（FATB）基因家族，以培育高油酸大豆。考虑到大豆的古多倍体基因组特征，研究人员设计了多条sgRNA，分别靶向种子发育期间表达的GmFAD2-1、GmFAD2-2和GmFATB基因。与仅靶向GmFAD2-1（油酸含量约83%）相比，对GmFAD2-2B、GmFAD2-2C和GmFATB1a的额外编辑将18:1脂肪酸含量提升至90%以上。GmFATB的编辑使SFA含量相比野生型（WT）显著降低40%以上。在仅编辑GmFAD2且GmFATB表达降低的株系中，同样观察到SFA绝对含量的下降。值得注意的是，所有评估的Williams82背景高油酸基因型在单位种子质量和单粒种子水平上均表现出高于WT的平均总脂肪酸（TFA）含量。对来自Williams82背景株系的805份单粒种子脂肪酸谱的相关性分析进一步揭示了18:1脂肪酸组成与单位种子质量TFA含量之间的关系。基因表达分析显示，三酰甘油（TAG）合成相关基因并无一致的表达上调，而糖依赖性三酰甘油脂肪酶1（SDP1）的表达则出现下调。与此相对，磷脂酸（PA）代谢相关基因，包括二酰甘油激酶（DGK）和磷脂酶D（PLD），出现部分上调。这些转录水平的变化支持了一个假说，即脂质周转的改变可能促进了高TFA表型的形成。综上，本研究明确了实现超高油酸、低饱和脂肪酸大豆的有效多重靶标组合。
**论文解读**
**一、研究背景与科学问题**
大豆（Glycine max）是全球重要的油料和蛋白作物，其油脂不仅用于食用，还广泛用于饲料和生物柴油生产，全球市场规模已超2000亿美元。然而，野生型大豆油的脂肪酸组成并不理想：约含13%棕榈酸（16:0）、4%硬脂酸（18:0）、20%油酸（18:1）、55%亚油酸（18:2）和8%亚麻酸（18:3）。高含量的多不饱和脂肪酸（PUFA）使大豆油在储藏过程中易发生氧化酸败，产生过氧化物和醛酮类次级氧化产物，严重影响油脂的稳定性和营养品质。
为改善大豆油脂品质，研究者长期致力于降低PUFA和饱和脂肪酸（SFA）含量、提高氧化稳定性优异的油酸（18:1）比例。脂肪酸去饱和酶2（FAD2）催化18:1向18:2的转化，是调控油酸积累的关键靶点。此前的研究表明，通过X射线诱变、RNAi干扰、TALEN或CRISPR/Cas9编辑等手段单独敲除种子特异性表达的GmFAD2-1A和GmFAD2-1B，可将油酸含量提升至约80%–83%。然而，要进一步突破90%的油酸阈值并同时降低SFA含量，需要拓展编辑靶标的范围。此外，大豆是古多倍体物种，基因组经历了约5900万年前和1300万年前两次复制事件，存在大量功能冗余的同源基因，使得通过单一基因编辑获得清晰表型变得困难。基于此，研究人员开展了本研究，旨在系统解析多重编辑GmFAD2和GmFATB基因家族对大豆种子脂肪酸组成的贡献。该论文发表于《Plant Biotechnology Journal》。
**二、关键技术方法概述**
本研究采用的主要技术方法包括：通过BLAST分析和系统发育树构建鉴定大豆FAD2和FATB基因家族成员，并利用RT-PCR分析其组织表达模式（样本来自Williams82品种的茎、种子、荚和叶片组织）；基于多sgRNA的CRISPR/Cas9载体构建（pHEE401E_4sg、pBAtC_4sg和pBAtC_6sg），采用改良Golden Gate组装方法；以栽培品种Williams82和Maverick为转化受体，通过农杆菌介导的半种子法进行大豆遗传转化，并以PPT叶片涂抹法筛选转基因植株；利用巢式PCR结合Illumina MiniSeq二代测序平台进行靶位点插入/缺失分析；采用气相色谱法（GC）进行种子脂肪酸组成与含量测定，以十五烷酸（15:0）为内标进行定量分析；通过RT-qPCR分析油脂代谢相关基因的表达变化。
**三、主要研究结果**
**3.1 大豆FAD2和FATB基因家族的鉴定与多重CRISPR/Cas9编辑设计**
研究人员通过序列比对和系统发育分析，鉴定出5个与拟南芥AtFAD2同源的大豆基因（GmFAD2-1A、GmFAD2-1B、GmFAD2-2B、GmFAD2-2C、GmFAD2-2E）和4个与AtFATB同源的基因（GmFATB1a、GmFATB1b、GmFATB2a、GmFATB2b）。组织表达分析显示，GmFAD2-1A和GmFAD2-1B为种子特异性表达，而GmFAD2-2基因和GmFATB基因在种子和叶片中均有表达。基于此，研究者将基因划分为主效组和次效组，并设计了多条sgRNA进行多重靶向编辑。
**3.2 多sgRNA CRISPR/Cas9载体构建及T0–T5代转基因植株繁育**
三个多sgRNA载体被成功构建并转化大豆，经PPT筛选和NGS分析确认了靶位点的编辑效率。转基因株系经过6年的世代推进——包括温室T0–T2代和LMO田间T2–T5代——最终获得了24个独立株系，代表了15种不同的插入/缺失类型，涵盖了对GmFAD2-1、GmFAD2-2和GmFATB1基因家族不同组合的编辑。
**3.3 GmFAD2和GmFATB编辑类型的脂肪酸组成与含量**
GC分析结果显示，油酸组成随编辑基因数量的增加而逐步升高：野生型油酸约20.4%；仅编辑GmFAD2-1A和GmFAD2-1B的完全敲除株系（2-1ab/-/-型）油酸达83.3%；在此基础上额外编辑GmFAD2-2B和GmFAD2-2C后，油酸升至约87.0%；进一步叠加GmFATB1a编辑的2-1ab/2-2ce/1a型株系，油酸含量达到最高值90.2%，同时16:0降至4.4%，18:0降至3.2%，18:2和18:3合计仅约0.1%–0.8%。值得注意的是，GmFAD2-2E的编辑对种子脂肪酸组成影响不显著，研究者推测其可能为非功能基因。此外，获得的内含子内缺失突变体（如3 bp和6 bp缺失）表现出低于完全敲除株系的油酸含量，提示GmFAD2-1A和GmFAD2-1B对18:2合成的贡献可能存在差异。
**3.4 GmFAD2单独编辑高油酸株系中种子SFA积累减少与GmFATB表达降低**
在仅靶向GmFAD2的株系中，SFA组成较野生型降低了约30%–40%。定量GC分析证实，这是SFA绝对含量的真实下降：WT中16:0和18:0含量分别为22.3 μg mg
?1种子和8.6 μg mg
?1种子，而2-1ab/-/-株系分别降至12.9 μg mg
?1种子和7.4 μg mg
?1种子。RT-qPCR分析进一步发现，所有GmFAD2-1编辑株系（包括内含子内缺失突变体）中，GmFATB1a、GmFATB1b、GmFATB2a和GmFATB2b的表达均较WT降低了约40%–70%。这表明GmFAD2编辑引发的SFA下降不仅与酰基辅酶A竞争机制有关，还可能通过下调GmFATB表达而减少SFA从头合成。
**3.5 Williams82背景高油酸株系总脂肪酸含量增加**
对805份来自T4和T5代的单粒种子GC数据进行的Pearson相关分析和LOWESS回归显示，18:1组成与18:2组成呈最强负相关（r = ?0.95），而总脂肪酸（TFA）含量与18:1含量呈最强正相关（r = 0.82）。进一步按转化事件来源、遗传背景和基因型比较分析发现，Williams82背景的所有高油酸株系TFA含量始终高于野生型，增幅约7%–24%，而Maverick背景株系的TFA含量则在不同世代间表现不一致，且部分低于野生型。
**3.6 高油酸株系种子TFA增加与脂质代谢相关基因表达分析**
对TAG合成途径基因的RT-qPCR分析表明，GmDGAT1A、GmDGAT2D和GmPDATA在高油酸株系中的表达下降至WT的10%–50%，GmDGAT1B和GmDGAT1C仅部分株系上调，提示TFA的增加并非源于TAG合成通量的提升。相反，参与种子发育后期脂质周转的糖依赖性三酰甘油脂肪酶1基因（GmSDP1）在多数高油酸株系中表达下调20%–80%。此外，磷脂酸（PA）代谢相关基因出现表达变化：GmLPAT14上调，GmPLDα3和GmPLDφ2表达增加，多个GmDGK基因（8、9、10、11、12）持续上调。结合田间气温记录（2024–2025年T4–T5代种子发育后期R7–R8阶段最低气温约4.7°C–6.9°C）和受控温度实验（WT与2-1ab/2-2c/1a株系在25°C/?R6.5和15°C/R7–R8条件下比较），高油酸株系在低温条件下仍维持高于WT的TFA含量。
**四、讨论总结与研究结论**
本研究系统明确了实现油酸含量超过90%所需的关键基因靶标组合——即同时突变GmFAD2-1A/B、GmFAD2-2B/C和GmFATB1a。研究发现，GmFAD2单独编辑即可降低SFA积累，其机制部分与GmFATB表达下调有关。相关性分析和受控实验表明，Williams82背景高油酸株系TFA含量的提高与GmSDP1表达降低及PA代谢相关基因表达改变相关联。综合田间温度数据、受控实验结果、基因表达变化以及拟南芥中关于PA通过AtPHL7调控AtSDP1表达的已有报道，研究人员提出了一个工作假说：种子发育后期的凉爽条件可能通过改变PA代谢水平，进而下调GmSDP1表达并减缓脂质周转，最终贡献于高油酸大豆种子TFA含量的提升。研究结论指出，FAD2突变不仅改变了脂肪酸组成，还可能通过影响脂质周转相关基因表达，参与调控种子发育后期的脂肪酸积累。
