多组学整合将GmISO5鉴定为大豆种子异黄酮生物合成的关键调控因子并涉及其对大豆花叶病毒（SMV）的响应

《Journal of Advanced Research》：Multi-omics integration identifies GmISO5 as a key regulator of seed isoflavone biosynthesis and implicates it in the response to soybean mosaic virus

　　

多组学整合分析将GmISO5鉴定为大豆种子异黄酮生物合成的关键调控因子，并涉及其对大豆花叶病毒（SMV）的响应。全基因组关联分析（GWAS）与转录组水平关联分析（TWAS）的整合将GmISO5鉴定为一个种子异黄酮位点；CRISPR/Cas9突变体总种子异黄酮含量下降约80%；GmISO5直接激活异黄酮途径中的GmHIDH和GmCHS1；GmISO5功能缺失伴随叶片异黄酮积累降低和对SMV的敏感性增加。

一、研究背景与科学问题

大豆（Glycine max (L.) Merr.）是全球重要的植物油和蛋白来源，其种子富含异黄酮类次生代谢物，具有抗氧化、抗癌等健康功效，并参与豆科植物与根瘤菌共生及抗病防御。异黄酮生物合成从苯丙烷和类黄酮途径分支而来，关键酶包括查尔酮合酶（CHS）、查尔酮异构酶（CHI）和异黄酮合酶（IFS）。异黄酮含量受多基因和环境因素共同控制，虽然已鉴定出多个MYB、锌指等转录因子调控因子，但解释种子异黄酮含量自然变异的关键因果调控因子仍不明确。磷脂酰乙醇胺结合蛋白（PEBP）家族成员已知调控开花、种子发育、萌发和胁迫响应，但此前尚未与异黄酮生物合成建立直接联系。因此，利用多组学整合策略鉴定种子异黄酮含量的关键位点，对大豆营养品质改良和抗病性研究具有重要意义。该论文发表于《Journal of Advanced Research》。

二、关键技术与方法

研究人员采用以下关键技术：①基于311份栽培大豆在北京三年田间表型（高效液相色谱法测定6种异黄酮组分）及4,765,428个SNP进行全基因组关联分析（GWAS，FarmCPU模型）；②利用204份大豆R5.5期种子转录组进行转录组水平关联分析（TWAS）；③利用1,566份重测序材料进行群体遗传与选择扫荡分析；④在Wm82背景下获得CRISPR/Cas9敲除株系iso5_L4和iso5_L5，结合RNA-seq和qRT-PCR进行转录组分析；⑤通过酵母单杂交（Y1H）、双荧光素酶报告（dual-LUC）和凝胶迁移（EMSA）验证直接靶基因；⑥通过独立成分分析（ICA）构建共表达网络；⑦接种大豆花叶病毒（SMV）并用DAS-ELISA评价病毒积累。

三、研究结果

【大豆种子异黄酮的多样性与遗传力】311份栽培大豆连续三年田间表型分析显示，糖苷型异黄酮含量显著高于苷元型，其中黄豆苷元型糖苷（genistin）占总量32.75%，苷元型genistein仅占4.23%；糖苷型组分与总含量相关系数最高（Pearson r=0.71–0.89）。广义遗传力（H²）分析表明，genistin和总异黄酮H²分别为0.57和0.52，苷元型H²仅为0.12–0.30。地方品种总异黄酮含量显著高于改良品种，南方材料高于北方材料，体现明显的地理分布特征。

【整合GWAS和TWAS鉴定种子异黄酮积累关键位点】基于4,765,428个SNP的GWAS共定位22个QTL（qISO1–qISO22），其中7个与已知QTL重叠。染色体5远端的显著信号在74 kb内聚集，连锁不平衡分析将候选区收缩至200.5 kb，命名为qISO.Gm05。TWAS基于154,119个外显子关联分析，鉴定出71个与异黄酮显著关联的基因，其中Glyma.05G244100重复关联到4种异黄酮组分，且位于qISO.Gm05内，被命名为GmISO5。

【GmISO5基因组变异与种子异黄酮含量相关】对1,566份重测序大豆的分析发现，GmISO5启动子和外显子区存在9个变异，形成两个主要单倍型。携带Hap1的种质外显子2使用比例显著高于Hap2，且总异黄酮及主要组分含量显著更高；Hap2则相反。因此将Hap1命名为高异黄酮单倍型GmISO5High，Hap2命名为低异黄酮单倍型GmISO5Low。

【GmISO5在大豆异黄酮生物合成中的功能鉴定】qRT-PCR显示GmISO5在发育种子中特异表达，并在开花后30天达峰，主要位于子叶和胚轴。在Wm82背景下获得两个独立CRISPR/Cas9敲除株系iso5_L4和iso5_L5，均导致外显子1移码突变。敲除后总种子异黄酮从野生型的1375.52 μg/g降至273.67 μg/g，降幅达80.1%。RNA-seq共鉴定出iso5_L4和iso5_L5中分别有4902和2682个差异表达基因，其中65个已知异黄酮生物合成基因中有30个受GmISO5调控，GO分析显著富集异黄酮生物合成过程。

【GmISO5直接激活GmHIDH和GmCHS1转录】qRT-PCR证实敲除株系中GmHIDH