IGFBP7通过增强OGDH介导的琥珀酸蓄积促进脓毒症诱导的多器官功能障碍

《Journal of Advanced Research》：IGFBP7 promotes sepsis-induced multiple organ dysfunction by enhancing OGDH-mediated succinate accumulation

　　

摘要 背景： 脓毒症是危重症的主要原因，源于宿主对感染的失调反应。多器官功能障碍综合征（multiple organ dysfunction syndrome, MODS）是脓毒症最严重的表现，与高死亡率密切相关。尽管脓毒症发病率持续上升，但目前的治疗策略，包括抗生素治疗、液体复苏和器官支持，在改善患者预后方面效果有限。因此，阐明脓毒症诱导MODS的机制并确定潜在的治疗靶点仍是迫切的研究重点。线粒体不仅是三磷酸腺苷（adenosine triphosphate, ATP）的主要来源，也是协调代谢适应、氧化还原稳态、钙信号和炎症反应的中心枢纽。越来越多的证据表明，线粒体功能障碍在脓毒症相关MODS的发病机制中起核心作用。胰岛素样生长因子结合蛋白7（insulin-like growth factor-binding protein 7, IGFBP7）参与多种生理和病理过程，研究人员既往研究已将其与糖尿病肾病（diabetic kidney disease, DKD）、急性肾损伤（acute kidney injury, AKI）和镉诱导的肝肾纤维化等疾病相关联。 方法： 研究人员通过酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）检测脓毒症患者及盲肠结扎穿刺（cecal ligation and puncture, CLP）诱导的脓毒症小鼠血清及组织中IGFBP7水平；利用全身性及器官特异性Igfbp7敲除小鼠评估IGFBP7在脓毒症诱导的MODS中的病理作用；通过液相色谱-串联质谱（liquid chromatography-tandem mass spectrometry, LC-MS/MS）分析鉴定IGFBP7相互作用蛋白；采用免疫共沉淀（co-immunoprecipitation, Co-IP）、Western blot、免疫荧光、透射电子显微镜及Seahorse细胞外通量分析等技术探讨其分子机制；并通过中和抗体治疗评估靶向IGFBP7的治疗潜力。 结果： 研究发现，脓毒症患者血清IGFBP7水平显著升高，脓毒症小鼠循环及多个器官中IGFBP7表达增加。全身性或器官特异性Igfbp7敲除可减轻脓毒症诱导的器官损伤和炎症。机制上，IGFBP7与2-氧代戊二酸脱氢酶（2-oxoglutarate dehydrogenase, OGDH）相互作用，减少OGDH与去琥珀酰化酶sirtuin 5（SIRT5）的结合，增加OGDH整体琥珀酰化水平并增强其酶活性，从而促进琥珀酸蓄积。琥珀酸蓄积进一步导致线粒体功能障碍，包括线粒体呼吸受损、ATP含量降低、线粒体DNA（mitochondrial DNA, mtDNA）拷贝数减少、线粒体碎片化及氧化应激增加。值得注意的是，抗IGFBP7中和抗体治疗在脓毒症小鼠中发挥了显著的保护作用，改善了多器官功能、减轻了组织损伤和炎症，并恢复了线粒体稳态。 结论： 本研究将IGFBP7确定为脓毒症发病机制的关键调控因子，揭示了IGFBP7-OGDH-琥珀酸轴在脓毒症诱导的MODS中的致病作用，为将IGFBP7作为脓毒症诱导MODS的潜在治疗靶点提供了新的见解和临床前依据。

IGFBP7通过增强OGDH介导的琥珀酸蓄积促进脓毒症诱导的多器官功能障碍：机制解析与治疗靶点评估

一、研究背景与科学问题

脓毒症是宿主对感染反应失调所导致的危及生命的全身性综合征，其最严重的表现形式为多器官功能障碍综合征（multiple organ dysfunction syndrome, MODS），与极高的死亡率密切相关。尽管脓毒症的发病率持续攀升，但当前以抗生素治疗、液体复苏和器官支持为核心的临床策略在改善患者预后方面收效甚微。因此，深入阐明脓毒症诱发MODS的分子机制并寻找有效的治疗靶点，是当前重症医学领域亟待解决的关键科学问题。

线粒体不仅是三磷酸腺苷（adenosine triphosphate, ATP）的主要生成场所，更是协调代谢适应、氧化还原稳态、钙信号转导及炎症反应的核心枢纽。大量证据表明，线粒体功能障碍在脓毒症相关MODS的发病进程中扮演核心角色。脓毒症状态下，除呼吸功能受损和ATP生成障碍外，线粒体质量控制过程亦遭到破坏，包括分裂-融合失衡、生物合成受抑和线粒体自噬异常，从而加剧氧化应激和炎症损伤。

胰岛素样生长因子结合蛋白7（insulin-like growth factor-binding protein 7, IGFBP7）参与多种生理和病理过程。与其它IGFBP家族成员不同，IGFBP7因对胰岛素样生长因子（insulin-like growth factor, IGF）亲和力较低而主要呈现非IGF依赖性功能。研究人员既往研究已证实IGFBP7在糖尿病肾病（diabetic kidney disease, DKD）、急性肾损伤（acute kidney injury, AKI）及镉诱导的肝肾纤维化等疾病中发挥重要作用。鉴于IGFBP7与多种病理状态下器官功能障碍的密切关联，探究其是否参与脓毒症相关MODS具有重要的科学意义和临床转化价值。

二、研究内容与主要发现

本研究首先在临床层面发现，脓毒症患者血清IGFBP7水平较健康对照显著升高，且与血清肌酐、血尿素氮（blood urea nitrogen, BUN）、丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase, ALT）和天冬氨酸氨基转移酶（aspartate aminotransferase, AST）水平呈正相关，提示IGFBP7与脓毒症相关器官功能障碍密切相关。在盲肠结扎穿刺（cecal ligation and puncture, CLP）诱导的脓毒症小鼠模型中，血清和尿液IGFBP7水平均显著增加，肾脏、肝脏和肺脏中IGFBP7蛋白表达明显上调，免疫荧光染色证实其在肾近端小管上皮细胞和肝细胞中表达增强。脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）刺激可显著上调小鼠原代肾小管上皮细胞（tubular epithelial cells, TECs）、原代肝细胞及永生化细胞系中IGFBP7的表达。

利用全身性Igfbp7基因敲除小鼠，研究人员发现Igfbp7缺失可显著提高CLP术后小鼠存活率，降低血清肌酐和BUN水平，减轻肾小管结构损伤，抑制肾损伤分子-1（kidney injury molecule-1, KIM-1）表达和核因子-κB（nuclear factor-κB, NF-κB）p65磷酸化，并下调促炎细胞因子肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α, TNF-α）、白细胞介素-1β（interleukin-1β, IL-1β）和白细胞介素-6（interleukin-6, IL-6）的mRNA表达。同时，Igfbp7缺失亦显著改善CLP诱导的肝功能损伤（降低ALT/AST）、减轻肝脏组织病理学改变和炎症反应，并缓解肺组织水肿、肺泡间隔增厚、毛细血管充血和炎性细胞浸润。进一步通过肾小管上皮细胞特异性（Igfbp7^flox/floxCdh16-Cre）和肝细胞特异性（Igfbp7^flox/floxAlb-Cre）敲除小鼠证实，器官特异性Igfbp7缺失同样可减轻相应器官的损伤和炎症。体外实验中，Igfbp7敲低可抑制LPS诱导的KIM-1表达和p65磷酸化，而Igfbp7过表达则产生相反效应；罗丹明B标记的重组IGFBP7蛋白可被肾小管上皮细胞内化。

在机制探索方面，研究人员通过免疫共沉淀联合液相色谱-串联质谱（liquid chromatography-tandem mass spectrometry, LC-MS/MS）分析，鉴定出2-氧代戊二酸脱氢酶（2-oxoglutarate dehydrogenase, OGDH）为IGFBP7的候选相互作用蛋白。Co-IP实验证实脓毒症小鼠肾脏、肝脏和肺脏中IGFBP7与OGDH存在相互作用，激光共聚焦显微镜观察到LPS刺激的肾小管上皮细胞中两者显著共定位。亚细胞分级实验显示，LPS刺激后线粒体组分中IGFBP7蛋白增加，而OGDH主要富集于线粒体组分。分子对接分析进一步支持两者的潜在相互作用，结构域作图实验表明IGFBP7的Kazal样和Ig样C2型结构域是介导与OGDH结合的主要区域。

OGDH是三羧酸（tricarboxylic acid, TCA）循环中将α-酮戊二酸转化为琥珀酰辅酶A的关键酶，进而参与琥珀酸的产生。研究发现，脓毒症小鼠血清和肾脏中琥珀酸水平显著升高，而Igfbp7缺失可使其基本恢复正常；LPS刺激的肾小管上皮细胞胞质中琥珀酸水平亦升高，Igfbp7敲低可抑制该效应。血清琥珀酸水平与血清IGFBP7、肌酐、ALT和IL-1β水平呈正相关。OGDH酶活性测定显示，CLP术后野生型小鼠肾脏OGDH活性显著升高，而Igfbp7敲除小鼠则降低；体外实验呈现一致趋势。鉴于琥珀酰辅酶A是赖氨酸琥珀酰化（一种蛋白质翻译后修饰，post-translational modification, PTM）的供体，研究人员进一步检测了OGDH的琥珀酰化水平。Co-IP实验表明，脓毒症小鼠肾脏和LPS刺激细胞中OGDH整体琥珀酰化水平升高，而OGDH与去琥珀酰化酶sirtuin 5（SIRT5）的结合减少。Igfbp7过表达可进一步降低OGDH-SIRT5结合并增加OGDH整体琥珀酰化水平。使用OGDH特异性抑制剂琥珀酰膦酸酯（succinyl phosphonate, SP）处理可降低LPS诱导的KIM-1和p-P65表达。为验证琥珀酸蓄积是否为IGFBP7致病作用的下游介质，研究人员给予Igfbp7敲除小鼠细胞通透性琥珀酸酯——二甲基琥珀酸酯（dimethyl succinate, DMS）。DMS补充可恢复脓毒症Igfbp7敲除小鼠血清琥珀酸水平，并显著逆转Igfbp7缺失对肾、肝、肺功能和结构的保护作用，同时恢复KIM-1和p-P65的表达水平，体外实验亦得到一致结果。

在线粒体功能层面，Igfbp7敲低可显著改善LPS刺激下肾小管上皮细胞的线粒体耗氧率，恢复ATP含量和线粒体DNA（mitochondrial DNA, mtDNA）拷贝数，改善线粒体形态（由碎片化恢复为 elongated 网络），恢复线粒体膜电位，并减轻氧化应激（恢复谷胱甘肽（glutathione, GSH）水平、降低丙二醛（malondialdehyde, MDA）含量）。在脓毒症小鼠肾脏中，Igfbp7缺失可改善线粒体动力学相关蛋白（DRP1、FIS1、MFF、OPA1、MFN1）的异常表达，恢复ATP和mtDNA水平，减轻氧化应激，并维持线粒体超微结构完整。

基于上述发现，研究人员评估了抗IGFBP7中和抗体的治疗潜力。在CLP诱导的脓毒症小鼠中，腹腔注射抗IGFBP7抗体可显著降低循环IGFBP7和琥珀酸水平，减少血清TNF-α和IL-1β浓度，改善肾、肝、肺功能指标，减轻组织损伤和巨噬细胞浸润，并改善肾脏线粒体动力学和生物合成相关蛋白的表达。此外，抗IGFBP7治疗还减轻了CLP诱导的肾脏衰老相关改变，包括p16、p21表达和衰老相关β-半乳糖苷酶（senescence-associated β-galactosidase, SA-β-gal）阳性率的降低。

三、关键技术与方法

本研究采用多种关键技术手段：临床样本来源于安徽医科大学第二附属医院，纳入脓毒症患者（n=12）和健康对照（n=10）；动物模型采用CLP诱导的脓毒症模型，使用C57BL/6小鼠（8-12周龄，雄性）；基因编辑技术方面，全身性Igfbp7敲除小鼠由赛业生物（Cyagen Biosciences，广州）构建，条件性敲除小鼠通过Igfbp7^flox/flox小鼠与Cdh16-Cre或Alb-Cre小鼠交配获得；蛋白相互作用分析采用免疫共沉淀联合LC-MS/MS质谱鉴定；分子机制研究运用Western blot、实时荧光定量PCR、免疫荧光、透射电子显微镜、Seahorse XFe24细胞外通量分析仪检测线粒体耗氧率；代谢物检测采用酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）；分子对接分析预测蛋白相互作用界面。

四、研究结果

1. IGFBP7在脓毒症患者和小鼠中表达升高： ELISA检测显示脓毒症患者血清IGFBP7水平较健康对照显著升高，且与肾功能（肌酐、BUN）和肝功能（ALT、AST）指标呈正相关。CLP诱导的脓毒症小鼠血清和尿液IGFBP7水平升高，肾脏、肝脏和肺脏中IGFBP7蛋白表达上调，免疫荧光证实其在肾近端小管上皮细胞和肝细胞中表达增强。LPS刺激可上调原代及永生化细胞中IGFBP7表达。

2. IGFBP7促进CLP诱导的脓毒症小鼠器官功能障碍、损伤和炎症： 全身性Igfbp7敲除显著提高CLP术后存活率，降低血清肌酐、BUN、ALT和AST水平，减轻肾、肝、肺组织病理损伤，抑制NF-κB活化和促炎细胞因子表达。肾小管上皮细胞特异性Igfbp7敲除改善肾功能并减轻肾小管损伤和巨噬细胞浸润；肝细胞特异性Igfbp7敲除降低ALT/AST水平并减轻肝脏炎症和损伤。体外实验中，Igfbp7敲低抑制LPS诱导的细胞损伤和炎症，Igfbp7过表达则增强上述效应，罗丹明B标记的重组IGFBP7可被细胞内化。

3. IGFBP7与OGDH相互作用并与琥珀酸蓄积相关： LC-MS/MS鉴定OGDH为IGFBP7相互作用蛋白，Co-IP证实两者在脓毒症小鼠肾、肝、肺组织中存在相互作用，激光共聚焦观察到LPS刺激细胞中两者共定位，亚细胞分级显示LPS后线粒体IGFBP7增加，分子对接支持两者结合，Kazal样和Ig样C2型结构域为关键结合区域。血清琥珀酸水平与IGFBP7、肌酐、ALT和IL-1β水平呈正相关。

4. IGFBP7减少OGDH-SIRT5结合并与OGDH琥珀酰化和活性增加相关： Igfbp7缺失使脓毒症小鼠血清和肾脏琥珀酸水平恢复正常，OGDH活性在Igfbp7敲除小鼠中降低。脓毒症条件下OGDH整体琥珀酰化水平升高，OGDH-SIRT5结合减少，Igfbp7过表达进一步加剧上述变化。OGDH抑制剂SP可降低LPS诱导的KIM-1和p-P65表达。

5. DMS补充逆转Igfbp7缺失的保护作用： DMS给药恢复Igfbp7敲除脓毒症小鼠血清琥珀酸水平，并逆转Igfbp7缺失对肾功能、肝功能、肺功能和组织损伤的保护作用，体外实验亦证实DMS可部分恢复Igfbp7敲低所抑制的KIM-1和p-P65水平。

6. IGFBP7抑制维持脓毒症期间线粒体稳态： Igfbp7敲低改善LPS刺激细胞的线粒体耗氧率、ATP含量、mtDNA拷贝数、线粒体形态和膜电位，减轻氧化应激。Igfbp7缺失改善脓毒症小鼠肾脏线粒体动力学蛋白表达异常、恢复ATP和mtDNA水平、减轻氧化应激并维持线粒体超微结构。

7. 抗IGFBP7治疗在脓毒症小鼠中发挥保护作用： 抗IGFBP7中和抗体降低脓毒症小鼠循环IGFBP7和琥珀酸水平，减少血清TNF-α和IL-1β，改善肾、肝、肺功能和组织损伤，减轻巨噬细胞浸润，改善线粒体动力学和生物合成，并减轻肾脏衰老相关改变。

五、讨论与结论

讨论部分指出，IGFBP7既往被广泛认为是AKI的生物标志物，并参与多种器官疾病。本研究将IGFBP7的作用扩展至脓毒症诱导的MODS，证实全身性和组织特异性Igfbp7缺失均可保护CLP诱导的多器官损伤。机制上，IGFBP7与OGDH相互作用，减少OGDH-SIRT5结合，增加OGDH整体琥珀酰化水平并增强其活性，促进琥珀酸蓄积。琥珀酸作为TCA循环的重要中间代谢物，过量蓄积可通过多种途径损害线粒体功能并促进病理过程。研究人员指出，虽然Igfbp7缺失的保护作用可被DMS补充部分逆转，但该实验尚不能确立通路特异性，过量琥珀酸还可能通过激活SUCNR1信号、稳定HIF-1α和诱导IL-1β表达以及复合物II依赖性琥珀酸氧化促进线粒体活性氧产生等机制发挥作用。此外，细胞衰老可能作为IGFBP7介导器官损伤的附加过程参与脓毒症进展。研究还讨论了IGFBP7靶向治疗的临床转化前景，包括既往发现的IGFBP7抑制剂（如左旋甲叶酸、沙美特罗）和本研究中的中和抗体策略。

研究结论指出，IGFBP7表达升高与脓毒症相关器官功能障碍相关。IGFBP7通过促进OGDH依赖性琥珀酸蓄积，进而导致线粒体功能障碍和全身性炎症。抗IGFBP7治疗可保护脓毒症诱导的多器官损伤，支持IGFBP7作为脓毒症诱导MODS的潜在治疗靶点。该研究发表在《Journal of Advanced Research》。