牛皮胶原蛋白肽联合苦瓜提取物的协同抗高血糖效应：AMPK–FoxO1通路参与及肠道菌群重塑

《Journal of Agriculture and Food Research》：Enhanced antihyperglycemic effects of cowhide collagen peptides by the combination with Momordica charantia extract: AMPK–FoxO1 pathway engagement and gut microbiota remodeling

　　

摘要专业翻译 牛皮胶原蛋白肽（collagen peptides, CP）与苦瓜提取物（Momordica charantia extract, MCE）通过静态猝灭和疏水相互作用形成非共价复合物。CP–MCE复合物提高了CP的热稳定性及消化后的肠道生物活性。在HFD/STZ诱导的2型糖尿病（T2DM）小鼠中，CP–MCE降低了空腹血糖并改善了葡萄糖耐量。CP–MCE增加了肝脏p-AMPK表达，降低了FoxO1/PEPCK水平，并提高了肝糖原含量。CP–MCE还调节了T2DM小鼠的肠道菌群和盲肠代谢物谱。

论文解读

一、研究背景与科学问题

胶原蛋白肽（collagen peptides, CP）是从动物皮肤、骨骼和软骨中提取的低分子量寡肽，具有抗氧化、降血压和抗衰老等多种生物活性。已有研究表明，CP可通过抑制二肽基肽酶-IV（dipeptidyl peptidase-IV, DPP-IV）延长肠促胰岛素半衰期，从而参与血糖调节。然而，仅靶向DPP-IV往往不足以实现有效的高血糖控制。持续高血糖可促进活性氧（reactive oxygen species, ROS）过量产生，而抗氧化防御能力受损会进一步加重氧化应激，这一失衡可能促使胰腺β细胞功能障碍、胰岛素信号受损及肝脏葡萄糖代谢失调，从而加速2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus, T₂DM）的进展。此外，调节肠道碳水化合物消化是控制餐后高血糖的另一重要策略，α-淀粉酶催化膳食淀粉的初始水解，其抑制可有效减缓葡萄糖释放。

目前增强肽类生物活性的策略多集中于金属螯合，但金属离子在特定条件下可能促进羟基自由基生成和DNA损伤，存在安全隐患。因此，利用天然生物活性成分作为辅助因子成为更安全的选择。植物提取物富含多酚、黄酮、三萜和皂苷类化合物，具有抗氧化、调节碳水化合物消化酶及葡萄糖调节潜力，可能补充肽类的DPP-IV抑制活性。然而，肽与植物提取物之间的非共价相互作用如何影响CP的理化性质、消化稳定性及功能表现，此前研究有限。因此，研究人员制备了CP–MCE非共价复合物，系统评估其结构特征、模拟胃肠消化后的体外生物活性及对T₂DM小鼠的抗高血糖效应，并探索肝脏葡萄糖代谢相关蛋白、肠道菌群和盲肠代谢物之间的关联。

二、研究设计与技术方法

研究人员从牛皮中提取胶原蛋白，经木瓜蛋白酶和复合蛋白酶依次酶解，收集分子量小于1 kDa的组分作为CP。在四种植物提取物（蓝李提取物、银耳提取物、桑叶提取物和苦瓜提取物）中，通过比较抗氧化活性和α-淀粉酶抑制活性筛选出MCE作为最佳配伍成分。主要关键技术方法包括：荧光光谱法结合Stern-Volmer方程和Van't Hoff方程分析CP与MCE的结合机制；AutoDock Vina分子对接模拟代表性肽段与苦瓜苷I的相互作用；傅里叶变换红外光谱（FT-IR）、差示扫描量热法（DSC）和扫描电子显微镜（SEM）表征复合物结构；体外模拟胃肠消化评估生物活性保留率。动物实验采用高脂高糖饮食联合链脲佐菌素（streptozotocin, STZ）诱导的T₂DM昆明小鼠模型（购自中国农业科学院兰州兽医研究所实验动物中心），分为正常对照（NC）、糖尿病模型（DM）、二甲双胍阳性对照（MH）、CP组和CP–MCE组，灌胃4周后检测空腹血糖、口服葡萄糖耐量、肝脏氧化应激指标、肝糖原含量、组织病理学、Western blot蛋白表达、16S rRNA肠道菌群测序及盲肠内容物非靶向代谢组学。

三、研究结果

3.1 植物提取物抗氧化活性与α-淀粉酶抑制活性评估

在相同浓度（2 mg/mL）下，四种植物提取物的抗氧化能力均强于CP。其中MCE的DPPH自由基清除活性为CP的4.83倍，ABTS清除活性比CP高58.62%，羟基自由基清除活性比CP高85.35%，综合抗氧化性能最优。在α-淀粉酶抑制方面，四种植物提取物的抑制活性均高于CP，但差异未达统计学显著水平。基于上述结果，MCE被选为与CP配伍的候选成分。

3.2 CP与MCE的相互作用机制

荧光猝灭分析显示，随着MCE浓度增加，CP的荧光强度逐渐降低，在MCE浓度达到0.35 mg/mL时结合趋于饱和。Stern-Volmer分析表明K_q值符合静态猝灭特征（≥2×10¹⁰ M^?1s^?1），说明CP与MCE形成了非荧光复合物。结合位点数接近1，结合常数K_A随温度升高而增大，ΔG为负值表明结合是自发的，ΔH和ΔS均为正值，提示疏水相互作用是驱动CP–MCE结合的主要作用力。分子对接结果显示，代表性胶原肽段GPVGPPG和GPVG与苦瓜苷I之间的复合物主要通过氢键和疏水相互作用（包括π-烷基和π-σ相互作用）稳定。

3.3 CP–MCE复合物的结构表征

FT-IR分析显示，CP的酰胺I带和酰胺II带在加入MCE后分别从1631.35 cm^?1和1537.53 cm^?1移至1640.22 cm^?1和1594.64 cm^?1，O–H伸缩振动带也发生位移，表明CP的C=O、N–H和C–N基团参与了与MCE功能团的相互作用。DSC分析显示，CP–MCE的两个吸热峰温度（56.29 °C和95.22 °C）均高于CP（53.87 °C和85.09 °C），且ΔH₂显著增加，表明MCE提高了CP的热稳定性。SEM观察显示，CP呈粗糙无定形碎片状结构，而CP–MCE形成具有中空褶皱的较大片状结构，提示CP与MCE的相互作用促进了小片段聚集重组为更大的连续结构。

3.4 模拟胃肠消化过程中的生物活性保留

体外模拟消化实验表明，胃消化阶段后CP和CP–MCE的活性保留率均保持在80%以上，二者无显著差异。肠消化阶段后，两种样品的生物活性保留率均显著下降，但CP–MCE的α-淀粉酶抑制活性、DPPH和ABTS自由基清除活性的保留率显著高于CP（P<0.05），表明MCE改善了CP在肠道环境中的消化稳定性。然而，肠消化后CP与CP–MCE的DPP-IV抑制活性保留率无显著差异，这可能与CP富含脯氨酸和精氨酸的氨基酸组成有关，进一步水解可产生含这些残基的短肽继续发挥DPP-IV抑制作用。

3.5 CP–MCE对T₂DM小鼠的降血糖效应

给药4周后，CP、CP–MCE和MH组的空腹血糖分别较第0周降低37.93%、38.58%和51.68%（P<0.01），均显著低于DM组。口服葡萄糖耐量试验中，CP和CP–MCE组的OGTT曲线下面积（AUC）较DM组分别降低22.18%和25.95%，表明CP改善了葡萄糖耐量，MCE的联合使用进一步增强了血糖调节能力。

3.6 CP–MCE的抗氧化应激效应

与NC组相比，DM组肝脏总抗氧化能力（TAC）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）和超氧化物歧化酶（SOD）活性显著降低，丙二醛（MDA）水平显著升高（P<0.01）。CP干预部分逆转了这些变化，而CP–MCE较CP单独使用进一步增强了抗氧化酶活性并降低了MDA水平，表明MCE在体内增强了胶原蛋白肽的抗氧化应激能力。

3.7 CP–MCE对肝糖原含量的影响

DM组肝糖原含量显著低于NC组（P<0.01），而CP、CP–MCE和MH组的肝糖原含量均显著高于DM组（P<0.01）。CP–MCE较CP单独使用进一步增加了肝糖原含量。PAS染色显示，STZ诱导后肝脏和肾脏的糖原染色强度和分布减少，CP、CP–MCE和MH治疗后糖原沉积得到改善，其中CP–MCE和MH组恢复更为明显。H&E染色显示，DM组出现肝细胞肿胀、胞质空泡化和肝索排列紊乱，以及肾小管排列不规则和扩张等病理改变，CP–MCE治疗后这些异常得到缓解，肝肾功能形态得到较好保留。

3.8 CP–MCE对肝脏AMPK和PEPCK/FoxO1信号通路的影响

Western blot分析显示，T₂DM小鼠的p-AMPK/AMPK比值较NC组显著降低，而CP、CP–MCE和MH组的p-AMPK/AMPK比值均显著高于DM组（P<0.05），表明这些干预促进了AMPK活化。DM组PEPCK表达较NC组显著升高，CP、CP–MCE和MH治疗减弱了PEPCK表达的升高，其中CP–MCE组的降低最为显著。同时，CP和CP–MCE也降低了FoxO1蛋白表达，提示抑制了FoxO1介导的糖异生基因转录激活。这些结果表明CP–MCE通过AMPK–FoxO1–PEPCK相关信号轴发挥抗高血糖作用。

3.9 CP–MCE对盲肠肠道菌群和代谢物的影响

16S rRNA测序显示，DM组的Firmicutes/Bacteroidetes（F/B）比值（3.86）高于NC组（3.04），而CP、CP–MCE和MH干预显著降低了F/B比值。属水平上，DM组Candidatus Arthromitus丰度升高、Anaerostipes显著减少，CP–MCE减弱了这些糖尿病相关变化。α多样性指数（Chao1、Shannon、Simpson和observed species）在DM组均显著低于NC组，CP–MCE提高了这些指数，表明微生物丰富度和多样性得到部分恢复。PCoA分析显示CP–MCE和MH处理样本向NC聚类方向偏移。

非靶向代谢组学共鉴定出89种显著差异代谢物。T₂DM诱导后，皮质醇、醛固酮和脱氢表雄酮（DHEA）等类固醇激素相关代谢物显著升高，而CP/CP–MCE干预使其向NC水平恢复。抗坏血酸（维生素C）、δ-生育三烯酚和9,10-环氧十八碳烯酸在T₂DM小鼠中显著降低，CP/CP–MCE减弱了这些降低。6-磷酸葡糖酸和甘露醇在T₂DM小鼠中升高，CP/CP–MCE使其降低。微生物组–代谢组关联分析揭示了Firmicutes、Bacteroidetes、Proteobacteria等菌门与多种代谢物之间存在显著相关性。

四、讨论总结与研究结论

该研究表明，CP–MCE配方较CP单独使用表现出更强的抗氧化能力、α-淀粉酶抑制活性、热稳定性及模拟胃肠消化后的生物活性保留率。在STZ诱导的T₂DM小鼠中，CP–MCE展现出优于CP的降血糖效果，并伴有葡萄糖耐量改善、肝糖原含量增加和肝脏氧化状态改善。这些效应伴随着肝脏p-AMPK/AMPK比值升高及FoxO1和PEPCK表达降低，支持AMPK–FoxO1–PEPCK相关信号通路的参与。CP–MCE治疗还与糖尿病相关盲肠菌群和代谢物谱改变的缓解相关。总体而言，CP–MCE可能代表一种有前景的T₂DM血糖管理膳食配方。