**基于核磁共振和量热法解析表皮葡萄球菌自溶素R2ab结构域介导聚苯乙烯表面附着的分子机制**

《Journal of Biological Chemistry》：The Mechanism of R2ab-mediated Attachment to Polystyrene Surfaces in Staphylococcus epidermidis

　　

摘要：葡萄球菌自溶素蛋白可水解细胞壁肽聚糖。自溶素的R2ab重复序列通过与细胞壁组分结合来引导催化结构域，并在生物膜形成过程中介导对非生物表面（如聚苯乙烯）的附着。表征蛋白质与表面的相互作用是理解细菌附着机制的重大挑战。本研究利用核磁共振波谱（NMR）技术，研究人员解析了R2ab结构域的溶液结构及骨架动力学特征。随后，结合核磁共振和量热法，研究人员鉴定了R2ab与细胞壁组分及聚苯乙烯表面的相互作用模式。基于溶液态的R2ab结构揭示了其与脂磷壁酸（LTA）和肽聚糖（PGN）的相互作用表面，研究人员鉴定了结合区域，并利用分子对接模拟了它们与R2ab的结合方式。R2ab还能与聚苯乙烯纳米颗粒（PSNP）发生相互作用。通过一种新颖的方法——对聚苯乙烯纳米颗粒进行顺磁性标记，研究人员鉴定了R2ab与聚苯乙烯的主要相互作用界面。顺磁弛豫增强（PRE）图谱、等温滴定量热法（ITC）和突变分析共同揭示，R2ab通过R2b亚基C末端一个明确的界面与聚苯乙烯表面结合。极性残基和带电残基（尤其是S776和K779）在吸附中发挥关键作用。这些发现支持一个模型，即R2ab充当分子桥梁，同时结合细胞壁组分和非生物表面。这凸显了R2ab在早期生物膜形成中的作用，并提示破坏这种相互作用可能减少表皮葡萄球菌对非生物表面的附着。

## 论文解读：表皮葡萄球菌R2ab结构域介导聚苯乙烯表面附着的结构基础与分子机制研究

**一、研究背景与问题提出**

表皮葡萄球菌（*Staphylococcus epidermidis*）是一种机会性致病菌，主要感染免疫功能低下人群，是医院获得性感染的主要病原菌之一。该菌在导管或植入物表面形成的生物膜构成重大生物医学挑战，此类感染极难根除，通常导致长期抗生素治疗甚至需手术移除植入物。生物膜生长已被认为是关键的耐药机制之一。

生物膜形成的首要步骤是细菌对生物或非生物表面的初始附着与定殖。目前已发现多种蛋白质参与葡萄球菌的表面附着过程，但介导初始附着至非生物表面的细菌蛋白结构模型一直未能明确。表皮葡萄球菌自溶素AtlE是一种被认为参与表面附着的关键蛋白，其正常功能是通过水解肽聚糖来维持细胞壁。AtlE包含一个N末端前肽、一个酰胺酶催化结构域Ami、三个串联的GW重复序列（R1ab、R2ab、R3ab）以及一个氨基葡萄糖苷酶催化结构域Glc。其中，R1ab和R2ab重复序列将Ami非共价锚定于细胞壁，而酰胺酶重复序列已被证实可介导生物膜形成，R2ab重复序列还能促进对聚苯乙烯表面的附着。然而，R2ab参与附着的结构特性一直未被阐明。鉴于R2ab在细胞壁重塑中的角色及其在生物膜中作为非生物表面黏附素的功能，研究人员开展了此项研究，旨在利用溶液核磁共振波谱和量热法解析R2ab的附着机制。

**二、研究目的与意义**

研究人员确定了R2ab的溶液结构，利用NMR弛豫技术鉴定了促进细胞壁结合的分子运动，通过等温滴定量热法鉴定了LTA的两种热力学独立的结合位点，通过NMR滴定鉴定了R2ab上的主要LTA结合位点，并首次鉴定了PGN结合位点。研究揭示了两个亚结构域均参与结合但整体结构变化很小。此外，研究人员开发了一种监测R2ab与聚苯乙烯表面结合的新方法——对聚苯乙烯纳米颗粒进行顺磁性标记，在残基水平上鉴定了R2ab与聚苯乙烯的结合界面，并构建了R2ab介导细菌附着聚苯乙烯表面的模型。实验设计的R2ab突变体在抑制生物膜生长方面显著弱于野生型R2ab，确认了该模型。综合结果表明，R2ab与细胞壁组分间的强相互作用以及明确的聚苯乙烯结合表面可在附着过程中形成结构稳定的初始附着复合物，靶向该复合物可能阻碍生物膜形成，为减少生物膜相关感染提供了新思路。

**三、关键技术方法概述**

研究人员采用大肠杆菌BL21(star) DE3表达系统对含N端6×His标签的R2ab蛋白进行表达与纯化，在M9基础培养基中利用¹⁵N-硫酸铵和¹³C-葡萄糖进行同位素标记。在密西西比州立大学Bruker Avance III 600 MHz和850 MHz NMR谱仪（均配备低温探头）上采集一系列多维NMR谱图进行骨架和侧链化学位移归属，利用非均匀采样技术获取三维谱图。通过¹⁵N编辑和¹³C编辑的NOESY-HSQC谱图获取距离约束，利用TALOS+程序获取扭转角约束，采用CYANA 2.1进行结构计算，CNS 1.3程序进行显式水分子动力学模拟精修。在600 MHz和900 MHz场强下采集¹⁵N弛豫参数并进行无模型分析。采用等温滴定量热法表征R2ab与细胞壁组分（购自InvivoGen的纯化金黄色葡萄球菌LTA和购自Sigma的PGN）以及聚苯乙烯纳米颗粒（购自Polysciences Inc.的羧基化聚苯乙烯微球，直径0.05 μm）的热力学相互作用。通过EDC/sulfo-NHS交联化学将4-氨基-TEMPO顺磁性自旋标记偶联至聚苯乙烯纳米颗粒的羧基，进行顺磁弛豫增强实验。利用CCDC GOLD软件进行LTA和PGN的柔性分子对接。使用表皮葡萄球菌生物膜产生菌株1301在96孔聚苯乙烯微量滴定板上进行生物膜实验，通过结晶紫染色法定量生物膜生物量。

**四、主要研究结果**

**（1）R2ab溶液结构：显著的环区运动，但为单一协同折叠单元**

R2ab的¹H-¹⁵N HSQC谱图显示良好的信号色散，149个骨架酰胺中141个获得归属。最终得到的20个结构整体（PDB ID: 7KWI）紧密聚集，有序骨架和重原子的均方根偏差分别为1.0 ?和1.5 ?。R2ab由两个半开放的β-桶状亚基R2a和R2b组成，每个亚基含有至少五条β-折叠片，并具有SH3b结构域典型的RT环、SU环、远端环和n-Src环。每个亚基的中央β-折叠含有一个GW基序（R2a中W763，R2b中W839），该基序是自溶素重复序列的保守特征并在配体结合口袋形成中发挥重要作用。C末端以短转角螺旋（K842-L845）为特征。亚基界面稳定，R2a的β5残基与R2b亚基的RT环和n-Src环残基之间观察到侧链NOE信号。与先前解析的晶体结构（PDB: 4EPC）相比，全局叠加RMSD为1.9 ?，但R2a亚基的RT环和远端环以及R2b亚基的SU环显示出更高的RMS偏差，提示环区具有更大的柔性。

¹⁵N弛豫速率和稳态¹⁵N-{¹H}异核NOE数据显示，R2a的RT环和n-Src环区域的hetNOE和广义序参数（S²，均值0.80 ± 0.01）降低，反映了这些区域在皮秒至纳秒时间尺度上的显著运动，而R2b亚基的对应环区因与R2a的直接接触而运动受限。R2b的SU环表现出较低的S²值和2–4 s^-1范围的化学交换贡献（R_ex），表明该环在微秒至毫秒时间尺度上存在可能对底物结合重要的构象运动。弛豫分析显示两个结构域作为一个整体旋转，有效旋转相关时间（τ_c）为11.3 ns，与16.5 kDa蛋白质相符。差示扫描量热法测得的熔融温度（T_m）和量热焓（ΔH_cal）分别为50.7 °C和92.8 ± 0.9 kcal mol^-1，化学变性实验测得的Van‘t Hoff焓（ΔH_VH）为70 ± 8 kcal mol^-1，变性剂m值为4.4 ± 0.4 kcal mol^-1 M^-1，对应的溶剂可及表面积变化与两个亚基协同去折叠一致。荧光化学变性和DSC实验共同表明两个结构域以单一协同单元方式折叠。

**（2）与细胞壁组分LTA和PGN的相互作用**

ITC结合曲线拟合表明R2ab-LTA相互作用可用双位点结合模型描述，第一位点具有较高亲和力（K_d 0.15 ± 0.1 μM），呈放热反应和有利的结合焓；第二位点亲和力约低六倍（K_d约1.0 ± 0.2 μM），呈吸热反应。NMR滴定实验显示在LTA存在下R2ab酰胺峰强度呈浓度依赖性降低，突出显示R2a亚基中一个由RT环残基（G716、L717、Y718、T719、T720、Y722、D723）、β3残基（K740、L744）和GW基序（G762、W763）组成的连续区域为主要LTA结合位点。分子对接模型显示LTA的磷壁酸部分主要通过RT环残基与R2a亚基形成疏水相互作用和氢键。PGN与R2ab的ITC实验显示单一结合位点模型，亲和力为微摩尔级（K_d 1.3 ± 0.2 μM），呈吸热反应。NMR化学位移扰动图谱显示R2a（V707、T739、Y755、T761、I770）和R2b（G775、L792、T794、Y800、Y808、L829、W839）的残基共同形成一个配体结合空腔。分子对接显示该空腔由众多极性残基和带电残基排列，适合容纳PGN的肽茎。LTA和PGN不结合于R2ab的相同位点，LTA对R2ab的结合倾向整体大于PGN。

**（3）R2ab与聚苯乙烯表面的相互作用及取向**

研究人员通过对羧基化聚苯乙烯纳米颗粒进行4-氨基-TEMPO顺磁性自旋标记，开发了一种在残基水平鉴定蛋白质-表面相互作用的创新方法。自旋标记使纳米颗粒直径从56 nm增至75 nm，表面电荷基本保持不变（ζ电位分别为?32 mV和?35 mV）。PRE实验显示R2ab酰胺质子强度随PSNP@TEMPO浓度增加而降低，且仅有特定残基/区域受PRE效应影响。I_para/I_dia比值分析显示，大多数显著受影响的残基（A712、V790、K791、W797、Y800、G809、A826、T827、S841、Y843、A847）位于R2b亚基背面的C末端面，形成一个大的连续区域，表明R2ab可能通过R2b亚基的C末端面与聚苯乙烯表面相互作用。ITC数据表明约200个R2ab分子与一个纳米颗粒相互作用，双位点结合模型拟合显示亚微摩尔亲和力（K_d = 520 nM），吸附由有利的焓贡献驱动，与静电相互作用一致。提高离子强度（100 mM和200 mM NaCl）可逐步减弱R2ab与PSNP@TEMPO的结合，进一步支持静电作用力对吸附过程的贡献。

**（4）R2ab预涂覆聚苯乙烯表面可抑制生物膜生长**

基于PRE实验结果，研究人员构建了R2ab的特异性点突变（Y722A、S776A、K779A、Y800A、Y843A、Y844A），将丝氨酸、赖氨酸和酪氨酸替换为丙氨酸以降低表面电荷和疏水性。生物膜实验表明，野生型R2ab预处理的聚苯乙烯孔板生物膜形成显著减少，酪氨酸突变体（Y722A、Y800A、Y843A、Y844A）并未显示出增强的生物膜形成。然而，S776A和K779A突变体预处理孔中的表皮葡萄球菌生物膜显著高于野生型R2ab或酪氨酸突变体，表明这两个极性/带电残基在聚苯乙烯吸附中发挥关键作用。两个残基均位于所提出的R2b亚结构域C末端结合区的边缘，提示它们可能充当特定的锚定接触点而非广泛吸附足迹的组成部分。

**五、讨论总结与研究结论**

蛋白质介导的对非生物表面的初始附着是表皮葡萄球菌在医疗器械上形成生物膜的关键第一步。研究人员综合运用溶液NMR波谱、量热法、分子对接、顺磁性标记聚苯乙烯纳米颗粒和生物膜实验，在残基水平上确定了R2ab的溶液结构和骨架动力学，表征了其与LTA、PGN和聚苯乙烯纳米颗粒的相互作用。结果表明，R2ab是一个结构稳定的串联SH3b样重复序列，含有不同但功能相连的表面，分别用于细胞壁配体结合和聚苯乙烯表面相互作用。R2ab的溶液结构确认为两个紧凑的半开放β-桶状亚基，类似于细菌SH3b样结构域，利用局部环区运动进行配体识别同时维持全局稳定的支架。

R2ab与LTA和PGN的相互作用支持串联SH3b样折叠提供多位点细胞壁识别表面的观点。ITC数据显示R2ab结合两个LTA配体，NMR滴定表明R2a亚基含有主要LTA结合位点。PGN结合则由R2a和R2b残基共同形成的亚基间空腔介导，LTA与PGN不竞争同一结合表面，这种安排可能允许在自溶素定位过程中同时与两种细胞壁组分结合。

顺磁性标记纳米颗粒PRE实验和突变分析支持下述模型：R2b亚基C末端面参与聚苯乙烯结合，而R2a和亚基间区域仍可用于与细菌细胞壁组分相互作用。综合数据支持R2ab在表皮葡萄球菌附着非生物表面的最早阶段充当分子桥梁的机制——R2a的RT环和GW基序为中心的一面识别嵌入细胞膜的LTA，R2a/R2b界面的独立空腔容纳来自细胞壁基质的PGN，而R2b明确的C末端表面则介导直接的聚苯乙烯吸附，其中极性和带电残基（包括S776和K779）发挥重要功能。预先将纯化的R2ab涂覆于聚苯乙烯表面可占据细菌黏附时通常识别的表面结合位点，从而抑制细菌附着。

研究结论：上述结构和功能数据不仅明确了R2ab如何与细胞壁组分和聚苯乙烯表面结合，还支持破坏R2ab介导的附着可能为减少表皮葡萄球菌在医疗器械上的生物膜形成提供一种策略。R2ab的溶液结构（PDB ID: 7KWI）和化学位移数据（BMRB ID: 30821）已提交至公共数据库。