转染优化对腺相关病毒纯化性能和载体质量的影响

《Journal of Bioscience and Bioengineering》：Impact of transfection optimization on adeno-associated virus purification performance and vector quality

　　

重组腺相关病毒（rAAV）作为基因治疗的病毒载体显示出巨大的前景。然而，高效生产满足临床需求的高质量 rAAV 仍然具有挑战性。在此，我们通过实验设计（DoE）方法优化了 rAAV 生产，以评估五个转染参数对载体基因组滴度、全颗粒比率（FE 比率）和病毒蛋白（VP）化学计量的影响。DoE 模型显示，没有单一组转染条件能同时最大化这三个响应值。随后，来自 DoE 优化转染的材料通过亲和层析随后进行阴离子交换层析（AEX）进行纯化。我们观察到，当衣壳负载较高时，AEX 回收率下降，这种情况是由高滴度与低 FE 比率的组合引起的，减少了通过转染优化实现的部分滴度增益。此外，AEX 从初始 FE 比率非常低的材料中富集全颗粒的能力有限。最后，来自 DoE 优化转染的材料显示出改善的转导效率，这与衣壳中 VP1 和 VP2 与总 VP 的比率有关。总体而言，本研究证明转染衍生的质量属性会影响纯化结果和整体载体质量。我们的研究结果强调了在转染优化过程中战略性平衡多个质量属性的必要性，并为上游转染和下游纯化的整合开发提供了见解。

章节片段

rAAV 生产

rAAV 通过三重转染方法生产。VPC 2.0（Thermo Fisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）悬浮细胞，源自 HEK293 细胞，在添加了 l-谷氨酰胺（日本大阪富士胶片和光纯化学公司）的 BalanCD HEK293（Irvine Scientific，美国加利福尼亚州圣安娜）培养基中，于 8% CO₂ 和 37 °C 条件下培养。转染混合物通过将质粒 pGOI (CMV-GFP)、pRep2Cap9、pHelper 和转染试剂 FectoVIR-AAV（Polyplus，法国伊利克希）混合制备于

使用 DoE 方法优化 rAAV 生产

使用 DoE 方法研究了转染时活细胞密度、质粒重量比、总 DNA 量和丁酸钠浓度对 rAAV 生产的影响。在我们的 rAAV 生产中，转染后 18 小时添加丁酸钠作为添加剂。初步实验表明，补充 3 mM 丁酸钠将 VG 滴度从 1.13 增加到 1.54 × 10¹¹ vg/mL（提高 36%），但将 FE 比率从 49% 略微降低到 41%。因此，我们决定

讨论

在本研究中，我们应用 DoE 方法通过三重转染优化 rAAV 生产，同时系统性地改变转染时的活细胞密度、总 DNA 量、pHelper/pRepCap 和 pHelper/pGOI 重量比以及丁酸钠浓度。通过 DoE 确定的趋势与先前的研究发现（表 S3）一致，支持了观察到的设计空间的稳健性。特别是，VG 滴度随着活细胞密度和总 DNA 量的增加而增加，直到一个

CRediT 作者贡献声明

Ekaputra Ramadhani: 写作 – 审阅与编辑，写作 – 原始草稿，方法论，调查，概念化。 Yasuo Tsunaka: 写作 – 审阅与编辑，方法论。 Mitsuko Fukuhara: 写作 – 审阅与编辑，方法论。 Susumu Uchiyama: 写作 – 审阅与编辑，项目管理，资金获取，概念化。

写作过程中 AI 和 AI 辅助技术的声明

在本工作的准备过程中，作者使用了 ChatGPT 和 Microsoft Copilot 来提高可读性和语言质量。使用这些工具后，作者根据需要审阅和编辑了内容，并对出版物的内容承担全部责任。

致谢

本研究得到日本医药品医疗技术综合机构支持的“基因和细胞治疗核心技术研发”资助项目（项目编号：授予 S.U. 的 JP24se0123004 和 JP24bk0304007）的支持。作者感谢 Edanz 编辑了本手稿的草稿。

Ekaputra Ramadhani|Yasuo Tsunaka|Mitsuko Fukuhara|Susumu Uchiyama