《Journal of Colloid and Interface Science》：Microfluidic confinement monitors oligomer forms of 1–40 β-amyloid peptide in kinetic study by AFM
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摘要淀粉样聚集物是多种病理的标志。淀粉样β蛋白（A-β）聚集物在阿尔茨海默病（AD）的病理生理过程中起着关键作用。了解其在早期阶段的生长机制，包括分子间和环境因素，可能有助于识别纳米尺度上的关键化合物，从而作为潜在的治疗靶点。介观限制是成核和生长动力学影响的一个强因素。因此，
摘要
淀粉样聚集物是多种病理的标志。淀粉样β蛋白（A-β）聚集物在阿尔茨海默病（AD）的病理生理过程中起着关键作用。了解其在早期阶段的生长机制，包括分子间和环境因素，可能有助于识别纳米尺度上的关键化合物，从而作为潜在的治疗靶点。介观限制是成核和生长动力学影响的一个强因素。因此，我们使用微流控来模拟成核动力学中的限制效应，并在空间和时间上控制A-β 1-40肽的浓度和沉积速率。原子力显微镜（AFM）揭示了四种不同类型的聚集物，按平均大小和形状分类；在24小时的观察窗口内没有纤维的证据，取而代之的是，当基底与本体溶液孵育时，纤维才出现。云母表面上聚集物的分布随孵育时间变化，并且取决于A-β 1-40的初始浓度。我们假设首层单层的吸附，以及四种不同形式之间通过动态转化依次进行成核和生长，建立了成核和聚集物生长的动力学模型。淀粉样聚集物总体积的浓度依赖性表现为幂律依赖关系，其指数约为4。该数值转化为由四个分子组成的最小稳定低聚物大小。水溶液中的分子动力学进一步显示，四聚体相对于较小的低聚物具有增强的内在稳定性，伴随着氢键和盐桥的非线性增加。这些结果表明，在限制条件下，A-β 40的最小稳定聚集物是四聚体，强调了这些小多晶型在神经病理过程中的潜在作用，并提示它们可作为体外研究的靶点。
引言
淀粉样蛋白的自聚集涉及二十多种所谓的构象病，包括阿尔茨海默病、帕金森病、库鲁-雅各布病，乃至二型糖尿病[1], [2], [3], [4]。在所有以认知功能丧失为特征的神经退行性疾病中，阿尔茨海默病是最常见的。阿尔茨海默病（AD）的主要标志是tau蛋白的细胞内聚集物和聚集的A-β肽的细胞外沉积。尽管近期关于淀粉样蛋白假说的争议[5]指出，脑内β淀粉样蛋白（A-β）的积累只是病理事件级联中的一步[6], [7]，但A-β聚集物仍然是疾病进展中的关键因素。此外，脑不同区域A-β沉积物的存在与认知下降不相关[8]，暗示其他毒性物种的存在。小的可溶性淀粉样肽聚集物已被证实与神经功能障碍的表达有关，这些障碍在脑中出现大量蛋白纤维和斑块的积累之前就已经表现出来[1], [9]。
阿尔茨海默病患者的大脑中含有淀粉样肽的可溶性和不可溶性聚集物，大量结果指向小/低聚聚集物是主要的神经毒性物种[10], [11]。淀粉样聚集途径涉及两个主要步骤：a）单体在滞后阶段缓慢成核为稳定的低聚物；b）随后的延伸阶段和纤维化[12]。在聚集开始时观察到多种离散结构，并被归因于单体、二聚体[13], [14], [15]、三聚体和更高级别的聚集物[16], [17]。早期的实验提供了有争议的结果，表明A-β的最小稳定形式可能是二聚体[13], [18]、三聚体、四聚体[19]，甚至更大的低聚物[20]，多达几十条肽[16]。这些结果几乎未考虑到限制和拥挤的环境，而这种环境可以显著降低熵对聚集的贡献。
淀粉样聚集的动力学取决于内在因素（二级结构稳定性、电荷）[21], [22], [23]和外在因素（离子强度、温度、信号肽、脂质稳态）[24], [25], [26], [27], [28]。此外，用于分析最小稳定聚集物的技术可能会影响其真实值的确定[29]。因此，所有这些参数都可能对迄今为止报道的最小稳定低聚物种的差异有所贡献。
在限制环境中系统研究淀粉样同分异构体转化，在受控浓度条件下，可能揭示关于聚集起始、最小稳定核形成、其演化及其在AD病理中作用的宝贵信息。来自1-40或1-42片段的A-β低聚物破坏了多个突触前或突触后神经元受体的生理功能，并导致氧化应激和神经炎症[30]。A-β低聚物的运输以及与氧化纳米颗粒[31], [32], [33]在细胞器间的相互作用是潜在破坏疗法的靶点。在人工模型中，通过引导神经母细胞瘤细胞群之间树突的生长来生成网络，研究了低聚物通过轴突和树突的传播[34], [35]。低聚物运输的影响可能通过记录皮层兴奋性神经元中的瞬态状态[36]、柔性微电极阵列[37], [38]或基于铁电材料[39]或其他功能纳米颗粒[40], [41]的其他电子设备，在体外和动物模型中加以研究。
由于淀粉样肽是内脊髓液（ISF）和脑脊液（CSF）[42], [43]的组成部分，在大脑脑室和神经元及胶质细胞周围循环，微区室可能在肽的构象稳定性以及其自组装和自组织中发挥重要作用。空间和几何约束会影响细胞决策，例如少突胶质细胞前体细胞的情况[44]。对于蛋白质而言，限制在分子（原子）水平上对其结构稳定性的影响已经得到评估[45]。然而，与蛋白质复合物限制相关的方面，例如淀粉样聚集物，只是部分系统地进行了研究。因此，研究限制环境中（与本体溶液环境相比）β淀粉样蛋白的聚集，对于理解淀粉样疾病的起始具有重要意义，特别是导致稳定低聚物的聚集物大小，这些低聚物然后通过单体整合或合并继续生长。有机分子在表面和界面上的成核和生长动力学可以通过描述分子间力和输出现象之间相互作用的主方程进行调查研究[46]。
在这里，我们使用原子力显微镜并结合多尺度建模，研究了限制流体环境中固液界面处β淀粉样肽的自组织，其长度为介观尺度。低聚物种的形成评估是作为微摩尔范围内的初始浓度的函数确定的，这高于脑脊液中所报道的浓度。微流控装置提供了一个简单直接的将单体限制在低表面能环境中的工具，这种环境类似于细胞膜附近的空间，其中低聚物形成受淀粉样片段浓度和邻近效应的影响。
章节摘要
结果与讨论
在标准沉积中，例如将1微升液滴滴在云母板上，尽管这种方法被广泛使用，但它不允许控制毛细管流对不同类型肽的浓度和沉积速率的影响。因此，我们使用由聚二甲基硅氧烷（PDMS）印章粘合在云母板上的微流控装置来为肽溶液的孵育创建限制环境（图1a）。虽然类似的装置已被用于研究排列
结论
淀粉样蛋白的浓度在聚集过程中起着重要作用，这些聚集物对神经元表现出选择性毒性[60]。我们的工作表明，淀粉样肽的自组织取决于肽的浓度，以非线性方式，而且四种群体之间的相互转化描述了从吸附单层到原纤维的聚集物生长机制。在高于微摩尔值的浓度下普遍存在低聚物，我们证明
微流控装置
微流控装置由聚二甲基硅氧烷（PDMS. Sylgard 184, Dow Corning）印章粘合在新剥离的云母板上制成。整个系统用PDMS密封，仅留有入口/出口孔用于填充肽溶液。PDMS
CRediT作者贡献声明
Pierpaolo Greco：撰写 – 初稿、方法论、调查、形式分析、数据管理、概念化。Adina N. Lazar：撰写 – 初稿、方法论、调查、概念化。Francesca Lugli：撰写 – 初稿、数据管理。Cristiano Albonetti：撰写 – 初稿、可视化、概念化。Eva Bystrenova：撰写 – 初稿、调查、概念化。Michele Bianchi：撰写 – 初稿、方法论。Luciano Fadiga：
利益冲突声明
作者声明以下财务利益/个人关系，可能被视为潜在的利益冲突：Pierpaolo Greco报告获得了费拉拉大学神经科学与康复系的资金支持。Francesca Lugli报告获得了博洛尼亚大学的资金支持。Cristiano Albonetti报告获得了国家研究委员会的资金支持。Eva Bystrenova报告获得了国家
致谢
本工作获得了欧盟地平线欧洲研究和创新计划（资助协议编号101098597）的资金支持，项目"Piezo4Spine"（FB）。此外，还获得了意大利卫生部（资助协议PNRR-POC-2022-12376380，项目"BLBC"（LF），以及费拉拉大学神经科学与康复系（PG，LF），通过研究项目"FIRD2024"（PG），以及意大利大学与研究部（PRIN资助2022SRHPF2和
Pierpaolo Greco|Adina N. Lazar|Francesca Lugli|Cristiano Albonetti|Eva Bystrenova|Michele Bianchi|Luciano Fadiga|Francesco Zerbetto|Fabio Biscarini
