IGFBP5通过非经典Wnt通路逆转人牙囊干细胞衰老缓解牙周炎的研究

《International Journal of Oral Science》：IGFBP5 alleviates periodontitis by reversing human dental follicle stem cell senescence via the non-canonical Wnt pathway

　　

改善健康和延缓衰老是医学研究的核心目标。骨衰老导致多种年龄相关疾病，包括牙周炎。牙囊干细胞（DFSC）是牙周再生治疗的理想种子细胞。胰岛素样生长因子结合蛋白5（IGFBP5）据报道发挥复杂且环境依赖的效应，然而其在DFSC衰老中的作用尚未明确。在本研究中，研究人员观察到IGFBP5表达在经历复制性衰老或过氧化氢（H?O?）诱导衰老的DFSC中显著下降。功能实验表明，IGFBP5过表达可缓解细胞衰老并增强成骨潜能，这一过程与非经典Wnt信号通路的调控相关。随后WNT5B被鉴定为参与介导IGFBP5促成骨效应的潜在下游调控因子。为将这些发现转化至临床应用，研究人员开发了Gel-vHA@oe-DFSC——一种用于细胞递送的纳米颗粒嵌入式水凝胶系统，该系统在大鼠模型中增强了DFSC的治疗效果并促进了牙周再生。综上，本研究揭示了IGFBP5在缓解DFSC衰老中的新功能，并提出了一种对抗牙周骨丧失的有前景的策略。

**论文解读：IGFBP5通过非经典Wnt通路逆转人牙囊干细胞衰老缓解牙周炎**

**一、研究背景与科学问题**

骨衰老以骨量和骨密度下降为特征，是机体衰老的早期表现之一。骨重塑平衡由成骨细胞与破骨细胞协调维持，在年龄相关性骨病中该平衡被打破，导致骨丧失。牙周炎是一种典型的年龄相关性骨病，以慢性炎症侵犯牙齿支持组织为特征，严重者可导致牙周结构不可逆的破坏。目前临床治疗常依赖侵入性手术，而干细胞疗法提供了有前景的替代方案。植入的干细胞不仅作为再生单元，还通过信号分子增强驻留细胞活性，重塑局部微环境。近期中国一项多中心临床试验表明，异体牙源性干细胞注射可改善牙周炎患者的临床结局，凸显了这一微创策略的潜力。

牙囊干细胞（DFSC）来源于神经嵴，属于间充质干细胞（MSC）样群体，具有自我更新、多向分化和低免疫原性等优势。DFSC因获取便捷、性状原始、增殖能力强且多向分化潜能突出，被视为口腔再生治疗的理想种子细胞。即使在牙周组织成熟后，DFSC仍通过补充衰老的功能细胞和介导损伤修复来维持牙周组织稳态。然而，干细胞衰老会损害组织维持与修复能力，治疗用细胞同样难以幸免。在牙周炎中，种子细胞的衰老可加剧局部炎症并破坏骨重塑，形成自我延续的恶性循环，导致治疗失败。尽管已知牙源性干细胞衰老会损害干性和成骨能力，其调控机制仍不完全清楚。

胰岛素样生长因子结合蛋白5（IGFBP5）是胰岛素样生长因子结合蛋白（IGFBP）家族中最保守的成员，是一种高亲和力结合胰岛素样生长因子（IGF）的分泌蛋白，通过胰岛素样生长因子1受体（IGF1R）信号影响细胞存活与生长。除IGF依赖性功能外，IGFBP5还具有转录调控和调节肿瘤生长等IGF非依赖性功能。值得注意的是，IGFBP5在骨组织中高表达，并可促进MSC的成骨分化。已有研究表明，IGFBP5可增强牙周膜干细胞的增殖和成骨能力，且在牙周炎模型中表达下调，而重组IGFBP5蛋白可通过JNK/ERK信号促进牙周修复。然而，IGFBP5是否能缓解DFSC衰老并调控其成骨分化——这一问题对其在衰老相关牙周治疗中的应用至关重要——此前尚属未知。此外，直接注射DFSC面临细胞存活和组织整合的挑战，需要借助生物相容性支架如甲基丙烯酰化明胶（GelMA）水凝胶来增强细胞活性并实现局部递送。

基于上述背景，本研究旨在鉴定DFSC衰老的关键分子驱动因素并评估其治疗潜力，以期为年龄相关性骨丧失提供新的治疗策略。该论文发表于《International Journal of Oral Science》。

**二、关键技术方法概述**

研究人员采用来自18岁以下健康个体新鲜拔除第三磨牙的人牙囊干细胞（hDFSC），以及来自3–5日龄新生Sprague-Dawley（SD）大鼠的牙囊干细胞（rDFSC）。通过H?O?处理（150 μmol/L，24小时）诱导氧化应激性早衰（OSS）模型，以连续传代至P12构建复制性衰老（RS）模型。利用RNA测序（RNA-seq）对年轻细胞（YC）、OSS和RS三组进行转录组分析，筛选差异表达基因。通过慢病毒载体构建IGFBP5敲低（sh-IGFBP5）和过表达（oe-IGFBP5）的DFSC。机制研究采用RNA-seq分析、KEGG通路富集、Western blot和qRT-PCR验证Wnt通路各分支关键分子，并利用重组人WNT5B蛋白和WNT5B中和抗体进行功能验证。为临床转化，研究人员合成乙烯基功能化纳米羟基磷灰石（vHA），将其整合入GelMA水凝胶制备Gel-vHA复合材料，负载oe-IGFBP5 DFSC构建Gel-vHA@oe-DFSC细胞递送系统。体内实验采用SD大鼠第二磨牙结扎法建立牙周炎模型，设立健康对照、PBS（未处理）、Gel-vHA（无细胞水凝胶）、Gel-vHA@DFSC和Gel-vHA@oe-DFSC共五组，术后4周行micro-CT扫描、组织学染色和免疫组织化学分析以评估牙周再生效果。

**三、主要研究结果**

**（一）IGFBP5表达在DFSC衰老过程中下降**

研究人员通过SA-β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）染色、细胞周期阻滞基因（P53、P21、P16）表达上调、DCFH-DA探针检测活性氧（ROS）水平升高，以及细胞迁移和活力下降，确认了OSS和RS两种衰老模型构建成功。同时，衰老DFSC的ALP活性和矿化能力显著受损，成骨标志物（ALP、RUNX2、OCN）表达下降。RNA-seq分析在OSS和RS模型中共鉴定出数千个差异表达基因（DEG），其中IGFBP5在OSS模型中下调超过5倍，在RS模型中下调69倍，位列显著衰老敏感基因。基因本体论（GO）分析显示两种模型中下调DEG均富集于系统发育和细胞外基质组织等术语。qRT-PCR和Western blot在mRNA和蛋白水平均验证了IGFBP5的下调，表明DFSC衰老损害成骨能力，IGFBP5可能是其中的关键调控因子。

**（二）IGFBP5过表达保护DFSC对抗H?O?诱导的衰老**

利用sh-IGFBP5慢病毒敲低IGFBP5后，SA-β-gal阳性细胞比例增加，P21和P16水平升高，ROS增加且细胞活力下降，成骨潜能也受损。相反，IGFBP5过表达（oe-IGFBP5）成功挽救了H?O?诱导的细胞活力丧失，增加了活细胞比例，并显著降低了SA-β-gal阳性细胞数、P21和P16表达水平以及细胞内ROS水平。细胞周期分析显示，IGFBP5缓解了H?O?诱导的G0/G1期周期阻滞。成骨潜能也得到恢复，表现为成骨标志物上调和矿化结节形成增强。除OCN外，OSS+oe-IGFBP5组的RUNX2和ALP表达仍低于YC组。这些结果证明IGFBP5过表达可保护DFSC对抗H?O?诱导的衰老。

**（三）IGFBP5通过非经典Wnt通路缓解DFSC衰老**

研究人员对OSS+oe-IGFBP5与OSS+Vehicle组进行RNA-seq分析，鉴定出796个上调基因和582个下调基因。KEGG富集分析显示Wnt信号通路在排名前三的受调控通路中。进一步将IGFBP5过表达后上调的通路与衰老模型中下调的通路取交集，鉴定出11条持续改变的信号通路。Western blot结果表明，IGFBP5过表达显著降低了非经典Wnt通路标志物（WNT5B、c-Jun、磷酸化c-Jun）的蛋白水平，而经典Wnt/β-联蛋白（β-catenin）通路组分（β-catenin、磷酸化β-catenin、磷酸化糖原合成酶激酶3β即GSK3β）未见显著变化。qRT-PCR结果与此一致：经典Wnt核心基因（CTNNB1、GSK、AXIN）变化相对温和（经典通路抑制因子DKK1除外），而多个非经典Wnt基因（WNT5A、WNT5B、WNT16、ROR2、FZD3、JUN、NKD1）则呈现显著差异表达。这些数据表明IGFBP5主要通过非经典Wnt通路影响衰老DFSC，WNT5B可能为关键调控因子。

**（四）WNT5B作为IGFBP5调控成骨的下游效应分子**

RNA-seq数据的再分析显示，在OSS和RS两种衰老模型中，IGFBP5表达下降与WNT5B表达上升呈现一致的逆相关，而IGFBP5过表达则显著下调WNT5B。在OSS+oe-IGFBP5细胞中加入重组人WNT5B蛋白后，IGFBP5过表达所增强的矿化结节形成被部分削弱，ALP、RUNX2、OCN等成骨标志物的表达下降，同时P16 mRNA水平升高但P21无显著变化。在RS模型中，使用WNT5B中和抗体处理衰老细胞可显著降低SA-β-gal阳性率，下调P16并上调成骨标志物mRNA水平，成骨染色也明显增强，但P21表达变化无统计学意义，表型挽救相对YC水平仍为部分恢复。这些结果表明IGFBP5通过抑制WNT5B及其相关的非经典Wnt信号来促进DFSC的成骨分化。

**（五）乙烯基纳米羟基磷灰石增强的GelMA水凝胶作为优化的细胞支架**

为标准化IGFBP5过表达DFSC的牙周治疗应用，研究人员利用原硅酸四乙酯（TEOS）和硅烷偶联剂YDH-151对nHA表面进行乙烯基功能化修饰，合成vHA。XPS证实了硅元素和乙烯基的引入，XRD确认修饰后仍保留nHA晶相结构，FT-IR检测到C=C和C–H新振动峰。DLS、SEM和TEM显示乙烯基修饰改变了nHA的粒径和聚集状态。Gel-vHA的抗压杨氏模量显著高于Gel-nHA，流变学测试显示Gel-1%vHA的储能模量显著高于对照组，SEM可见Gel-vHA形成均匀多孔结构，溶胀率低于纯Gel水凝胶，降解实验表明Gel-vHA初始阶段具有优越的重量稳定性。

**（六）Gel-vHA@oe-DFSC促进成骨分化和牙周再生**

体外实验中，CCK-8检测显示Gel-vHA在H?O?诱导氧化应激下于第3天和第7天恢复了细胞活力。活/死染色表明H?O?+Gel-vHA@oe-DFSC组死细胞减少而活细胞增殖增强。细胞骨架染色显示细胞铺展面积增加，提示Gel-vHA有利于DFSC黏附和增殖。第14天时Gel-vHA@oe-DFSC组ALP mRNA表达显著恢复。在大鼠牙周炎模型中，micro-CT分析显示Gel-vHA@oe-DFSC组牙骨质-釉质界（CEJ）至牙槽骨嵴顶（ABC）的距离显著减小，最接近健康对照组，骨密度（BMD）和骨体积分数（BV/TV）也优于其他治疗组。H&E染色显示Gel-vHA@oe-DFSC组炎性浸润最轻微且与健康组织最相似，Masson三色染色显示其胶原纤维致密且排列有序。免疫组织化学（IHC）显示该组RUNX2和I型胶原（Col-Ⅰ）表达显著上调；衰老相关蛋白GLB1在牙周炎大鼠中表达上调，经Gel-vHA@oe-DFSC治疗后下调；局部IGFBP5水平升高而WNT5B水平降低，验证了体外发现的通路变化。

**四、讨论与结论**

本研究首次建立了衰老DFSC的基因组表达谱，确认衰老同时损害增殖能力和分化潜能。数据表明IGFBP5在此过程中表达下降，其恢复可减轻氧化应激并挽救成骨程序。在机制层面，IGFBP5通过下调WNT5B抑制非经典Wnt信号，从而恢复细胞功能并促进骨形成。JNK/c-Jun信号是细胞衰老的关键正向调控因子，c-Jun在衰老细胞中表达和磷酸化水平升高与衰老生长阻滞状态的建立和维持相关。本研究中IGFBP5过表达后c-Jun水平降低，提示JNK/c-Jun介导的促衰老信号受到抑制，这与IGFBP5过表达DFSC增殖和成骨能力增强的表型一致。此外，WNT5B蛋白的加入逆转了IGFBP5过表达的促成骨效应，而WNT5B中和可部分挽救RS细胞的衰老表型，表明IGFBP5与WNT5B之间存在功能性拮抗关系。

为将上述发现转化为临床应用，研究人员开发了Gel-vHA@oe-DFSC复合支架。该系统中，vHA通过共价键整合入GelMA网络，改善界面相容性并增强机械支撑。IGFBP5蛋白含有一个与HA特异性相互作用的肝素结合域，研究者提出这种特异性结合可增强支架机械完整性、延缓降解速率，并建立持续的局部微环境以引导干细胞命运。体内实验证实该系统在大鼠牙周缺损模型中展现出良好的骨再生性能。

研究结论：本研究首次确立了IGFBP5在缓解DFSC衰老中的关键作用，该过程涉及非经典Wnt信号轴的调控。IGFBP5表达可作为移植前体外扩增DFSC衰老的分子指标，而Gel-vHA@oe-DFSC支架为局部干细胞递送提供了临床可转化的平台。本研究的临床意义在于证明：在植入前使衰老DFSC恢复活力而非仅移植原始干细胞，可显著增强牙周骨再生。通过IGFBP5等靶向干预使衰老干细胞年轻化，可通过同时缓解细胞衰老和恢复成骨潜能，为系统性衰老相关骨病提供有前景的治疗策略。未来研究应着重于在老年患者临床DFSC分离株中验证IGFBP5-WNT5B调控轴，优化水凝胶配方以实现微创口内注射，并在大型动物牙周缺损模型中评估长期安全性和有效性。