《Journal of Human Genetics》：Characterising the motif composition and allele length distribution of ZFHX3 GGC repeat expansions in amyotrophic lateral sclerosis
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锌指同源框3（ZFHX3）基因中编码纯合多聚甘氨酸（polyG）序列的致病性GGC重复扩增可导致脊髓小脑性共济失调4型（SCA4）。其他SCA基因位点的中间长度扩增已被认为与肌萎缩侧索硬化症（ALS）相关，同时重复基序组成（repeat motif compo
锌指同源框3（ZFHX3）基因中编码纯合多聚甘氨酸（polyG）序列的致病性GGC重复扩增可导致脊髓小脑性共济失调4型（SCA4）。其他SCA基因位点的中间长度扩增已被认为与肌萎缩侧索硬化症（ALS）相关，同时重复基序组成（repeat motif composition）被认为会影响神经退行性疾病的致病性。鉴于ALS与SCA之间的遗传多效性（genetic pleiotropy），研究人员评估了ZFHX3 GGC扩增是否与ALS相关，并对重复基序组成进行了特征分析。研究人员利用ExpansionHunter对欧洲血统ALS病例和健康对照的短读长全基因组测序（WGS）数据中的ZFHX3 GGC重复大小进行了基因分型。通过REViewer对重复大小进行可视化检查，并从子集中手动推导基序构型。受试者工作特征（ROC）分析和Youden's J统计量确定了候选重复大小阈值。采用逻辑回归（logistic regression）检验重复长度和基序组成与ALS的关联，同时采用回归模型评估临床表型。在5785例ALS病例和7982例对照中，未观察到ZFHX3扩增与ALS风险之间的关联。较长等位基因显示出与较晚发病年龄的名义关联，但经Bonferroni校正后该关联不再显著。在802例ALS病例和800例对照中，共鉴定出50种不同的基序组成，其中11种编码纯合polyG序列，与致病性SCA4扩增特征一致；没有一种与ALS相关。尽管未观察到与ALS的关联，但本研究确定了ZFHX3重复基序组成和构型的动态性质。重复大小内部及之间的变异（包括纯合polyG重复）支持在评估神经退行性疾病风险时同时考虑基序组成和等位基因长度。
**论文解读**
**一、研究背景与意义**
肌萎缩侧索硬化症（ALS，一种以上下运动神经元进行性退化为特征的致死性神经退行性疾病）的遗传病因具有高度异质性，目前已鉴定出超过30个致病基因和1000余个遗传变异。其中，C9orf72基因内含子中的致病性短串联重复（STR，short tandem repeat）扩增是最常见的遗传病因，占家族性ALS的40%和散发性ALS的约10%。值得注意的是，ALS的遗传景观因多效性而更加复杂——同一突变可导致不同表型，如C9orf72重复扩增同时也是额颞叶痴呆（FTD，frontotemporal dementia）最常见的遗传病因。越来越多的遗传学证据表明，ALS与脊髓小脑性共济失调（SCA，spinocerebellar ataxia，一组以进行性平衡丧失、协调障碍和构音不清为特征的神经退行性疾病）之间存在遗传多效性：ATXN1和ATXN2中的致病性CAG重复扩增分别导致SCA1和SCA2，而这些基因中的中间长度CAG扩增已被证实与ALS风险增加相关。
近年来，锌指同源框3基因（ZFHX3，编码一种调控神经元和肌源性细胞分化及细胞增殖的转录因子）第10外显子中的编码区致病性GGC重复扩增被鉴定为北欧血统家族中SCA4的病因。ZFHX3中超过41个GGC重复的纯合多聚甘氨酸（polyG）扩增导致基因的致病性功能获得（gain of function），引发神经元变性——这是SCA和ALS共同的标志性病理特征。此外，SCA4患者同样表现出脊髓前角运动神经元丧失和后索退化，与ALS病理表现一致。
在polyG疾病和SCA中对STR的研究已突出表明，基序组成（即扩增重复中核苷酸或氨基酸的精确序列）至关重要，因为同义或错义中断基序的存在和配置可修饰疾病表型和临床表现。例如，NOTCH2NLC基因中的GGC扩增导致神经元核内包涵体病（NIID），携带多个GGA同义中断的患者表现为肌肉无力表型，而携带较少GGA基序和更多AGC（丝氨酸）错义中断的患者则以帕金森综合征为主。此外，ATXN2中与帕金森病、路易体痴呆和ALS风险特异性相关的中间长度CAG扩增含有GAA同义中断，在不改变编码氨基酸的情况下改变了重复基序组成。重复序列中的中断主要被认为通过阻止DNA复制和修复过程中的滑动来维持基因组稳定性，但也可能调节疾病表型和临床表现的变异性。因此，在评估STR扩增与疾病的关联时，同时评估基序组成和构型至关重要。
鉴于SCA与ALS之间的表型重叠和遗传多效性，以及基序组成在STR中日益被认识的重要性，研究人员旨在评估ZFHX3 GGC重复扩增是否与ALS相关，并在大型欧洲血统ALS和对照队列中系统表征其基序组成和构型特征。尽管最终未发现ZFHX3扩增与ALS风险之间的显著关联，但本研究首次揭示了该位点重复基序组成的显著动态性和多样性，为神经退行性疾病中STR的评估策略提供了重要启示——即应同时关注基序组成而不仅仅是等位基因长度。
**二、关键技术方法**
本研究初始纳入6114例ALS患者和8030例健康对照。ALS诊断依据El Escorial标准，队列包括943例来自麦考瑞大学神经退行性疾病生物样本库和澳大利亚MND DNA银行的澳大利亚参与者，以及5171例来自Project MinE数据冻结2（涵盖14个国家的国际ALS基因组学联盟）的参与者；对照队列包括1801例Project MinE健康个体和6229例来自gnomAD欧洲（非芬兰）STR数据下载v3.1.2的对照。通过PLINK v1.9进行主成分分析（PCA），筛选与HapMap CEU和TSI人群聚类的欧洲血统样本。使用ExpansionHunter v5从GRCh38比对的BAM文件中进行ZFHX3 GGC重复扩增基因分型，并通过TRTools进行合并和汇总。对73个≥24 GGC单位的等位基因使用REViewer v2进行可视化验证。对802例澳大利亚ALS参与者和800例随机选取的健康对照的重复基序组成进行手动可视化编目。采用ROC分析和Youden's J统计量确定候选重复大小阈值，使用性别校正的逻辑回归检验关联，并在ALS队列内采用线性回归、逻辑回归和Cox比例风险回归评估临床表型，以Bonferroni校正显著性阈值（P<0.0167）进行多重检验校正。
**三、研究结果**
**（1）队列概况（Cohort summary）**
经血统和重复质量过滤后，共保留5785例ALS参与者（802例澳大利亚ALS，4983例Project MinE ALS）和7982例健康对照（6215例gnomAD对照，1767例Project MinE对照），总计13767例个体。ALS队列中61%为男性，对照组中74%为男性。430例ALS患者携带已知致病性ALS致病变异（涉及C9orf72、SOD1、TARDBP和FUS）。观察到性别间发病部位（P<0.001）和发病年龄（P<0.001）存在显著差异：71%的男性表现为脊髓发病，女性为59%；女性平均发病年龄为61.2岁，男性为58.7岁。发病年龄较小的个体疾病持续时间更长（P<0.001）。66%的ALS患者为脊髓发病，脊髓发病者发病年龄更年轻（P<0.001）且疾病进展较延髓发病者更慢（P<0.001）。男性疾病持续时间长于女性（P<0.001）。上述特征与已发表的ALS队列数据一致。
**（2）ZFHX3 GGC重复长度频率分布（Frequency of ZFHX3 GGC repeat lengths）**
在11570个ALS等位基因和15964个健康对照等位基因中，ZFHX3 GGC重复长度范围分别为4至30单位和5至29单位。无一例个体携带超过SCA4家族中报道的致病阈值41个GGC重复的扩增。ROC分析和Youden's J统计量确定重复长度24为病例-对照关联检验的最佳阈值。逻辑回归未发现ZFHX3 GGC重复扩增≥24单位与ALS之间存在显著关联（OR=1.63，95% CI=0.98–2.72，P=0.058）。在ALS队列内部，携带≥24重复单位扩增的个体与较短重复携带者相比，发病年龄较晚（β=4.85年，95% CI=0.37–9.33，P=0.034），但经Bonferroni多重检验校正后该关联不再显著。将最长ZFHX3等位基因作为连续变量建模时，每个额外的GGC重复与0.70年较晚发病相关（β=0.70年/重复，95% CI=0.05–1.35，P=0.034），方向一致。未观察到与延髓vs脊髓发病（OR=1.05，95% CI=0.45–2.21，P=0.911）或疾病持续时间（HR=0.85，95% CI=0.56–1.30，P=0.459）的关联。排除C9orf72重复扩增及SOD1、TARDBP和FUS致病性变异携带者后的二次分析结果与此一致。
**（3）ZFHX3重复基序组成和构型的变异性（Variability of repeat motif compositions and configurations in ZFHX3）**
在802例澳大利亚ALS个体和800例健康对照的共3204个等位基因中，鉴定出50种不同的重复基序组成。所有基序组成均至少被一个GGT（甘氨酸）基序中断，产生polyG序列中的同义中断。其中三分之二（32/50）的基序组成仅存在于单个个体中。11种基序组成（涵盖21个等位基因：9例ALS，12例对照）缺乏错义中断，编码纯合甘氨酸序列，大小范围为5至26个重复基序。一例ALS患者两个等位基因均携带纯合polyG序列（重复长度分别为23和26）。逻辑回归未发现纯合polyG序列与ALS之间的关联（OR=0.63，95% CI=0.24–1.54，P=0.319）。最常见的基序组成（存在于84.7%的ALS等位基因和84.3%的对照等位基因中）见于21个重复的等位基因，由18个GGC（甘氨酸）基序、2个GGT（甘氨酸）同义中断基序和1个AGT（丝氨酸）错义中断基序组成。每个重复长度存在多种基序组成构型，但长度5、25和26各仅有一种构型；长度19和23的等位基因构型多样性最高（各8种）；长度21的等位基因中断基序变异性最大，在6种不同基序组成中观察到5种不同的非经典GGC基序。双错义中断存在于137个等位基因中（74例ALS，63例对照），最常见的组合为AGT（丝氨酸）和GAC（天冬氨酸）基序。
**四、讨论与结论**
本研究未发现ZFHX3 GGC重复扩增与ALS风险之间的关联，这与ATXN1和ATXN2中间长度扩增与ALS的关联形成对比。然而，在ALS队列内部，较长ZFHX3等位基因携带者倾向于更晚发病，这一趋势与SCA4中扩增长度越长发病越早、疾病严重程度越高的模式相反。观察到的等位基因远短于致病性SCA4扩增，且主要含有重复中断，这表明ZFHX3非致病范围内的变异可能具有与长纯合polyG扩增不同的生物学后果。虽然与发病年龄的关联经多重检验校正后不再显著，但该趋势值得作为ALS发病的潜在修饰因素进一步研究。
本研究观察到的等位基因与致病性SCA4扩增之间的区别也突显了基序组成和序列架构在重复扩增疾病中的重要性。在多聚谷氨酰胺（polyQ）和polyG疾病中，中断模式、基序顺序和序列纯度可影响重复不稳定性、外显率和发病年龄。本队列中鉴定出50种不同的ZFHX3重复基序构型，均含有至少一个同义或错义中断，另有11种编码纯合polyG序列。相比之下，致病性SCA4扩增由长纯合、不间断的polyG序列组成。纯合重复序列被认为更易发生复制滑动和体细胞不稳定性，从而易于进一步扩增；相反，含有中断的序列可能赋予基因座稳定性。此外，重复序列的中断模式和基序构型可能独立于重复长度影响转录和RNA加工。理解同义或错义中断如何影响和稳定重复扩增，可为旨在通过引入中断来稳定致病性重复序列的治疗策略提供信息——该策略目前正在其他重复扩增疾病中被探索。
本研究存在若干局限性：尽管队列规模较大，但分析仅限于欧洲血统个体，鉴于ALS具有遗传异质性且突变频率因祖先背景而异，未来纳入多样化祖先人群的研究对于更明确评估ZFHX3 GGC扩增和基序构型对ALS风险的贡献至关重要；短读长测序数据对于STR分析具有固有局限性——超过读长的重复无法直接跨越、GC富集基序可能引入覆盖偏倚、中断或结构复杂的重复可能无法可靠解析；详细的基序组成仅在队列子集中进行了手动表征，这些构型的人群频率和更广泛分布需要在更全面的人群中进行系统评估。
**研究结论：** 总之，研究人员未发现ZFHX3 GGC重复扩增导致ALS风险、发病部位或疾病持续时间的证据，也未发现纯合polyG序列与ALS存在关联，而等位基因长度与ALS发病年龄之间的关系需要进一步研究。然而，该基因座重复基序构型的显著多样性突显了在评估神经退行性疾病中的STR时，审查序列组成而不仅仅是等位基因大小的重要性。未来整合长读长测序、多样化人群和详细表型数据的研究，对于确定非致病性ZFHX3重复变异或基序架构是否修饰ALS发病，以及定义其在ALS和相关疾病中更广泛的遗传和生物学相关性至关重要。
