SRSF2 P95H突变诱导人造血干祖细胞的单核系定向分化启动

《Leukemia》：SRSF2 P95H induces monocytic priming of human hematopoietic stem and progenitor cells

　　

摘要专业翻译 剪接因子SRSF2的突变常见于患有克隆性造血（CH）的健康个体中，此类突变赋予克隆较高的年增长率并显著提升向骨髓增生异常综合征（MDS）/急性髓系白血病（AML）转化的风险。相应地，SRSF2突变在骨髓增生异常肿瘤（MDS，10-15%）、急性髓系白血病（AML，10%）及慢性粒单核细胞白血病（CMML，高达40%）患者中频繁出现。复发性突变均为杂合性且主要影响第95位脯氨酸，其中P95H替换最为常见。作为剪接体（spliceosome）的组成部分，SRSF2通过结合外显子剪接增强子（ESE）促进外显子识别。P95H突变改变了SRSF2的ESE识别基序，导致mRNA的广泛异常剪接。尽管少数复发性异常剪接事件可直接关联至骨髓发育不良的发生，SRSF2突变对造血干祖细胞（HSPCs）的转化性影响仍知之甚少。 本研究通过双等位基因内源敲入（KI）策略，专门填补了这一空白，捕获了原代人HSPCs中SRSF2突变获得的即时、细胞内在后果。与既往依赖患者来源样本或过表达系统的研究不同，该策略能够在不受克隆演化及共突变效应干扰的条件下，实现早期分子事件的时间分辨解析。 研究人员利用CRISPR/Cas9及重组腺相关病毒血清型6（rAAV6）介导的KI策略，将人脐带血（UCB）来源的HSPCs工程化为携带杂合SRSF2P95H/WT突变的状态，并分析了最早的分子变化。鉴于SRSF2突变型髓系肿瘤主要发生于成体造血中，使用UCB来源HSPCs是该模型的一个局限。因此，研究人员在可行情况下于成人动员外周血（mPB）来源的CD34+ HSPCs中进行了正交验证实验，以检验关键分子及功能发现在成人细胞背景下是否可重现。由Cas9蛋白和靶向SRSF2外显子1的化学修饰sgRNA组成的核糖核蛋白（RNP）复合物被电穿孔导入HSPCs，随后通过rAAV6递送编码密码子优化的野生型（WT）或突变型（P95H）SRSF2 cDNA的供体模板。该方法确保了WT及P95H序列在读码框内整合至内源SRSF2基因座，保留了天然调控元件（启动子和5'非翻译区）。每个rAAV6载体中引入3'荧光报告基因盒（GFP、BFP或mCherry），可实现双重转导（如P95H-GFP + WT-BFP），随后通过流式细胞分选（FACS）纯化双报告基因阳性细胞，从而产生纯合性杂合突变体（SRSF2P95H/WT）。相同的双等位基因KI策略被用于生成匹配的WT对照细胞（SRSF2WT/WT）。由于纯合或半合子SRSF2突变是致死的，内源双等位基因KI策略对于创建可存活的杂合SRSF2P95H/WT细胞至关重要。该策略还使得在受控条件下研究早期SRSF2突变驱动的改变成为可能，规避了长期体外选择或患者来源样本遗传复杂性的混杂效应。该方法在独立供体间可靠地产生了WT和突变型HSPCs（双报告基因阳性WT/WT：8.0 ± 3.2%，P95H/WT：7.6 ± 2.2%，n = 5），在后续分析前通过FACS富集至>95%纯度。双等位基因及位点特异性整合通过in-out PCR和Sanger测序得到确认。重要的是，工程化WT与突变细胞之间的总SRSF2蛋白水平保持不变。

论文解读

一、研究背景与科学问题

剪接因子SRSF2的突变是髓系肿瘤中最为常见的剪接因子突变之一，在健康个体的克隆性造血中即可检出，并赋予克隆较高的年增长率及向MDS/AML转化的显著风险。在临床层面，SRSF2突变见于10-15%的骨髓增生异常肿瘤（MDS）、10%的急性髓系白血病（AML）以及高达40%的慢性粒单核细胞白血病（CMML）患者中。复发性突变均为杂合性且主要集中于第95位脯氨酸，其中P95H替换最为常见。SRSF2作为剪接体的核心组分，通过结合外显子剪接增强子（ESE）促进外显子识别；P95H突变改变了SRSF2的ESE识别基序，导致mRNA的广泛异常剪接。然而，既往研究多依赖于患者来源样本或过表达系统，难以区分突变本身的即时细胞内在效应与克隆演化、共突变等混杂因素带来的影响。SRSF2突变对造血干祖细胞（HSPCs）的转化性影响，尤其是突变获得后最早期的分子事件，仍缺乏系统解析。因此，亟需一种能够在受控条件下、以时间分辨率捕捉突变即刻后果的实验模型。

二、研究设计与核心发现

研究人员采用CRISPR/Cas9与重组腺相关病毒血清型6（rAAV6）介导的双等位基因内源敲入（KI）策略，将人脐带血（UCB）来源的原代HSPCs工程化为携带杂合SRSF2^P95H/WT突变的状态，并生成匹配的SRSF2^WT/WT对照细胞。该策略通过将WT和P95H序列分别偶联不同荧光报告基因盒，经FACS纯化双报告基因阳性细胞，确保产生纯合性杂合突变体，同时规避了纯合突变致死的限制。研究在突变引入后第5天即进行RNA测序分析，捕捉了突变获得后最早期的剪接和转录变化，并在成人动员外周血（mPB）来源的CD34⁺ HSPCs中进行了正交验证。研究得出以下核心结论：SRSF2^P95H/WT突变在数天内即可在原代人HSPCs中建立疾病相关的异常剪接程序，并伴随转录水平上的单核系定向分化启动和功能层面的单核系分化偏移，CLEC12A被鉴定为该早期单核系启动的可追踪表面标志物。

三、主要关键技术方法

研究人员使用了以下关键技术方法：第一，CRISPR/Cas9核糖核蛋白（RNP）复合物电穿孔结合rAAV6供体模板递送的双等位基因内源敲入策略，实现内源基因座上的杂合突变引入；第二，基于荧光报告基因（GFP、BFP、mCherry）双阳性的流式细胞分选（FACS）纯化，获得高纯度杂合突变细胞；第三，RNA测序结合差异剪接和差异表达分析，系统解析突变后的分子变化；第四，RT-PCR验证关键异常剪接事件；第五，流式细胞术检测细胞表面标志物表达；第六，甲基纤维素集落形成单位（CFU）实验评估分化潜能。样本来源包括5例独立UCB供体来源的HSPCs及成人mPB来源的CD34⁺ HSPCs，并利用公共MDS患者数据集（GEO: GSE58831）及10个公开的SRSF2突变型AML、MDS和CMML患者RNA-seq剪接数据集进行交叉验证。

四、研究结果

SRSF2^P95H/WT在原代人HSPCs中快速建立疾病相关的异常剪接程序。 突变引入后第5天，RNA测序即检测到广泛的差异剪接事件，涵盖既往已报道的基因（如ATF2、TPM3、INTS3）及未报道的新靶基因（如EFCAB14、OSBPL3）。在外显子跳跃、内含子保留和可变剪接位点使用三类事件中，高幅度变化（ΔPSI > 10%）的基因以外显子跳跃最为富集。富集分析显示这些差异剪接基因（DSGs）涉及白血病细胞状态及从TP53活性调控到RNA代谢的多种细胞过程。工程化细胞与10个公开的SRSF2突变型AML、MDS和CMML患者样本剪接数据集存在显著重叠，其中14个基因在所有临床实体及工程化模型中均呈复发性异常剪接，并在独立患者队列中经RT-PCR验证。该结果证明疾病相关的SRSF2^P95H/WT剪接程序在突变获得后数天内即已建立。

SRSF2^P95H/WT突变在转录水平上引导HSPCs向单核系定向分化。 差异表达分析显示，突变细胞中单核细胞相关基因（FCN1、NCF2、TLR2、CLEC12A）上调，而红系谱系相关基因（HBB、HBA1/2、HBG1/2、ALAS2）下调，提示突变细胞早期向髓系-单核系定向分化。富集分析进一步支持髓系细胞特征（单核细胞和树突状细胞）及TNF-α和炎症反应信号的增强，同时红系前体细胞和血红素代谢特征相应下调。由于CRISPR/Cas9和rAAV6编辑本身可诱导HSPCs的应激和炎症程序，研究人员强调这些炎症信号需谨慎解读，但WT和突变细胞经历了完全相同的编辑流程，支持基因型特异性差异反映的是突变P95H等位基因的效应。

CLEC12A被鉴定为SRSF2^P95H/WT驱动的早期单核系启动的可追踪表面标志物。 通过过滤差异表达基因中预测的细胞表面定位蛋白，CLEC12A（CLL-1/CD371）被鉴定为最一致上调的候选表面标志物之一。流式细胞术证实了UCB和mPB来源的工程化SRSF2^P95H/WT HSPCs及其髓系-单核系后代的CLEC12A表面表达显著增加。在独立的公共MDS患者数据集中，SRSF2突变型HSPCs同样表现出CLEC12A上调。该上调具有SRSF2^P95H/WT特异性，在SF3B1和U2AF1突变体中未观察到。鉴于CLEC12A已被提出作为MDS/AML原始细胞的免疫表型标志物并用于双特异性抗体和CAR-T细胞开发，该发现提示SRSF2突变型髓系肿瘤可能值得在未来CLEC12A靶向诊断或治疗研究中予以重点关注。

SRSF2^P95H/WT突变赋予HSPCs功能性的单核系分化偏移。 甲基纤维素集落形成单位（CFU）实验显示，UCB和mPB来源的SRSF2^P95H/WT细胞单核细胞集落（CFU-M）显著增加，同时红系集落（BFU-E）减少。该功能层面的分化偏移与转录层面的单核系启动一致，并复现了慢病毒操作HSPCs和转基因小鼠模型中的发现（单核细胞产生增加及贫血征象），也与高达40%的CMML患者携带SRSF2突变的临床观察相吻合。

五、讨论与结论

研究讨论指出，观察到的转录组变化可能是上游调控因子差异剪接的继发事件，也可能反映了SRSF2的非经典功能，包括R-loop积累、复制应激、ATR通路激活或对mRNA上表观转录组m⁵C标记的读取。异常剪接改变与转录特征之间的机制联系仍需深入探究。研究结论为：杂合SRSF2^P95H/WT突变在原代人HSPCs中快速诱导疾病相关的异常剪接，并伴随单核系定向分化的转录和功能特征；该定向分化可通过CLEC12A细胞表面表达进行追踪，提示其作为潜在生物标志物和进一步治疗探索的候选靶点。此外，该研究提供了一个新型的、受控的原代人HSPC模型，用于解析早期白血病发生事件，并通过将细胞内在分子特征与疾病相关表型联系起来，促进突变特异性脆弱点的识别。