BRD9 降解剂在滑膜肉瘤中释放 GBAF 染色质重塑活性

《Cancer Research》：BRD9 Degraders Unleash GBAF Chromatin Remodeling Activity in Synovial Sarcoma

　　

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摘要

滑膜肉瘤将SS18::SSX融合癌蛋白整合入含有GLTSCR1的BRG1/BRM及关联因子（GBAF）复合物中，这使得其依赖于GBAF亚基BRD9。然而，使用多种BRD9降解剂的滑膜肉瘤临床试验未能实现具有临床意义的缓解。在本研究中，我们确定了阐明这些结果的机制框架。BRD9耗竭可抑制基因组改变极少的滑膜肉瘤的增殖，而这种特征在试验参与者中较为罕见。在培养的细胞、异种移植模型和重组纯化的复合物中，BRD9缺失不影响GBAF的组装。尽管BRD9降解减少了滑膜肉瘤中GBAF在靶位点上的富集，但缺乏BRD9的复合物维持甚至增强了染色质可及性和相关基因转录。使用纯化重组GBAF进行的生化实验表明，在缺乏BRD9的情况下核小体滑动增加。综合这些发现，BRD9抑制GBAF活性，BRD9降解通过融合癌蛋白分布的GBAF增加酶促重塑和靶基因表达。这种微妙的表观遗传扰动为滑膜肉瘤超越设下了低门槛，限制了BRD9降解剂的治疗效果。意义：BRD9抑制GBAF染色质重塑复合物，导致BRD9降解后SS18::SSX复合物活性增强而非受损，并解释了药理学BRD9降解剂在滑膜肉瘤中无效的原因。

引言

滑膜肉瘤是一种致命的恶性肿瘤，通常由单一的遗传改变引发，即18号和X号染色体之间的易位，产生包含SS18几乎全部编码序列与SSX1、SSX2或SSX4羧基末端尾编码序列融合的融合基因（1, 2）。天然SS18蛋白（最初命名为SYT）与哺乳动物SWI/SNF复合物结合，通常称为BRG1/BRM及关联因子（BAF）复合物（3–6）。与之一致，融合癌蛋白SS18::SSX高度组装入BAF复合物中，扰乱其染色质重塑活性并将转录改变为致癌状态（7）。BRD9选择性结合BAF复合物组分（5）：它仅存在于含有GLTSCR1的GBAF复合物中（8），也被称为非经典BAF（9–12）。在首次被描述于GBAF之前，BRD9通过DRIVE的短发夹RNA（shRNA）筛选在多种癌细胞系中被确定为滑膜肉瘤的特殊依赖因子（13）。这一依赖关系也得到了Broad DepMap的CRISPR筛选的证实（14）。在DRIVE数据公开后，滑膜肉瘤细胞系对BRD9的依赖通过shRNA、CRISPR/Cas9和化学蛋白水解靶向嵌合体（PROTAC）降解剂得到验证（9, 11）。Brien及其同事（9）证明BRD9标记了融合癌蛋白SS18::SSX在染色质上的主要宿主复合物，观察到BRD9降解后SS18::SSX在染色质靶位点上的富集水平降低。Michel及其同事（11）认为BRD9的依赖是由经典BAF复合物（CBAF）中SMARCB1的丢失造成的，因为SS18::SSX融合排除了SMARCB1组装入BAF复合物（6）。在滑膜肉瘤中观察到的SMARCB1水平降低现已了解是源于整个CBAF的降解（15），而非SMARCB1本身的选择性排除。Michel及其同事（11）还报告了一个非常明确但令人好奇的观察结果：BRD9耗竭后滑膜肉瘤细胞系中的转录变化与融合蛋白耗竭后的变化重叠很少。如果BRD9的主要染色质分布伴随融合蛋白，且BRD9耗竭促使融合蛋白在这些位点的富集减少，为什么相关靶基因的转录没有朝平行方向变化？文献中这一明显的矛盾尚未解决，本文对此进行了探讨。BRD9降解剂FHD-609和CFT8634被带入临床试验（分别为NCT04965753和NCT05355753），是最早进行人体测试的PROTAC降解剂之一（16–18）。两个项目均实现了强烈的靶向BRD9降解，但面临挑战，最终因未能取得令人信服的治疗反应而被终止。滑膜肉瘤仍然是一种对于进展性疾病无可用的根治性治疗的癌症，构成了未满足的医疗需求，并且是癌变融合蛋白引发的BAF功能获得性失调的典范。BRD9在滑膜肉瘤中重要性的发现提供了一个合理的合成致死假说，但BRD9降解剂的临床令人失望的结果强调了更深入理解滑膜肉瘤及其他背景下GBAF机制的必要性。在对滑膜肉瘤中BRD9耗竭进行了十余年的研究后，我们提出，不仅在典型的I期临床试验人群中预计BRD9降解的细胞减灭效果欠佳，而且BRD9降解的机制生物学影响——在此揭示为GBAF活性的获得——可以解释这种糟糕的疾病控制和潜在的对靶毒性。

材料与方法

伦理学

研究按照公认的伦理准则进行（例如，《赫尔辛基宣言》、国际医学科学组织理事会、《贝尔蒙报告》和美国共同规则）。所有涉及人类样本的实验均在知情同意方案下获取的样本上进行，其使用被批准为这些实验的豁免方案。所有小鼠实验均在经国际实验室动物评估与认证协会（AAALAC International）批准的设施中，根据严格审查的脊椎动物人道处理方案进行。

细胞系

经认证的HS-SY-II、ASKA和SYO-1由T. Nielsen提供（补充表S1；参考文献19–21）。MoJo由实验室生成（22）。HEK293T购自ATCC，EXPI293购自Thermo Fisher Scientific。所有细胞系均常规检测并确认无支原体污染，使用支原体检测试剂盒（InvivoGen）。细胞在含有10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素-链霉素的DMEM或RPMI 1640培养基中培养。每6个月由犹他大学DNA测序核心使用短串联重复序列分析（24个位点检测）进行细胞系认证。

shRNA表达载体和病毒转导

BRD9 shRNA序列被克隆入pLKO-Tet-On诱导型载体系统。通过将shRNA表达载体与包装质粒（pLP1、pLP2和VSVG）共转染HEK293T产生慢病毒。转染24小时后更换培养基，48小时后收获病毒上清并通过0.45 μmol/L醋酸纤维素滤膜（Corning，#430314）过滤。通过在聚凝胺存在下（终浓度8 μg/mL）向细胞中加入慢病毒上清进行滑膜肉瘤细胞系的慢病毒感染。细胞在室温下离心感染30分钟（500 g）。次日更换培养基，并用嘌呤霉素选择稳定细胞池：HS-SY-II为0.5 μg/mL；1,273/99为1 μg/mL；SYO-1为0.2 μg/mL。转导细胞用100 ng/mL多西环素（Dox）处理以诱导shRNA表达。

细胞周期阻滞实验

通过碘化丙啶（PI）染色后用流式细胞术分析细胞周期分布。简言之，细胞接种于六孔板中并用Dox（100 ng/mL）处理或不处理。处理后收获细胞，用冷PBS洗涤两次，在-20°C下用70%乙醇固定过夜。固定细胞用PBS洗涤，在37°C下用RNase A孵育30分钟，随后在避光条件下用PI（50 μg/mL）染色30分钟。使用流式细胞仪测量DNA含量，每个样本至少收集10,000个事件。数据用FlowJo v11分析，量化G0/G1期、S期和G2/M期细胞百分比以评估细胞周期阻滞。

BRD9-shRNA表达细胞的集落形成和细胞计数实验

集落形成和细胞计数实验通过将约2,000至5,000个细胞/孔接种于六孔板中（各实验中标注），一式三份，接种1天后用Dox（终浓度100 ng/mL）处理或不处理，每2至3天用Dox继续处理。5至10天后，细胞用胰蛋白酶消化并用Vi-CELL计数。细胞在达到所需汇合度后（约10至13天）用结晶紫染色可视化集落。

细胞增殖实验

使用CellTiter-Glo发光细胞活力测定法（Promega）按制造商说明测量细胞增殖。细胞以1×103个细胞/孔的密度接种于96孔白色不透明板中，过夜贴壁。细胞用WA-68以指定浓度处理7天。处理结束时，板在室温平衡30分钟，每孔加入等体积的CellTiter-Glo试剂。轻柔混合2分钟以诱导细胞裂解，板在室温孵育额外10分钟以稳定发光信号。使用BioTek微孔板读数仪记录发光。相对细胞增殖/活力通过将发光值归一化至未处理对照孔计算。所有实验均至少在三个生物学重复中进行。

Ki-67免疫组化

细胞在盖玻片上培养至60%至80%汇合度，然后用4%多聚甲醛在室温下固定15分钟。固定细胞用0.1% Triton X-100透化10分钟，并在PBS中用5% BSA封闭1小时。细胞在4°C下用抗Ki-67一抗（货号#ab16667）过夜孵育。洗涤后，细胞在室温下用适当的荧光或辣根过氧化物酶（HRP）偶联的二抗孵育1小时。细胞核用DAPI（荧光）或苏木精（HRP检测）复染。通过在显微镜下计数每个盖玻片上至少五个随机视野来定量Ki-67阳性细胞。

细胞系来源异种移植中的Dox诱导型shRNA表达

无胸腺裸小鼠[Crl:NU (NCr)-Foxn1nu]购自Harlan。表达BRD9特异性shRNA的HSSYII和SYO1细胞皮下注射入小鼠（2×10?个细胞/100 μL/小鼠）。肿瘤建立后（约150 mm3），荷瘤小鼠随机分配到治疗组。通过给予Dox饮食（Purina TestDiet，货号#5SL5 Mod LabDiet 5053含400 ppm Doxy，红色）诱导shRNA表达。每周两次使用卡尺测量肿瘤体积，体积按公式（长×宽2）/2计算。小鼠按照机构动物护理和使用指南进行维护和监测。

靶向降解蛋白质组学实验

将MV4-11细胞接种于六孔板中，用WA-68（10 nmol/L、100 nmol/L、1 μmol/L或10 μmol/L）或DMSO对照处理6、24或48小时。处理后，细胞在75 μL裂解缓冲液中裂解和超声，然后在90°C下加热15分钟。每个样本取100 μg总蛋白与10 μL内标（50 fmol/μL）混合，定容至100 μL，转移至96孔板中。用胰蛋白酶过夜消化蛋白，用离心柱（700 × g，3分钟）清理肽段，在N?下干燥，并用20 μL重新溶解进行分析。

BioID

稳定转导BRD9-BioID2-V5或V5-BioID2-BRD9的HD-MY-Z细胞以每个六孔板2 mL中5×10?个细胞的密度接种，培养48小时。用Dox（1 μg/mL，24小时）诱导表达。为了邻近标记，加入生物素（50 μmol/L；Sigma-Alcricht，货号#14400）4或24小时。收获并裂解细胞；用抗V5（Invitrogen，#R960-25）和抗BRD9抗体（Cell Signaling Technology，货号#58906，E9R2I和Bethyl Laboratories #A303-781A）通过免疫印迹验证融合蛋白表达，并使用链霉亲和素-HRP（Invitrogen，货号#S911）检测生物素化蛋白。为了质谱（MS），澄清裂解液在4°C下与200 μL Dynabeads MyOne Streptavidin C1（Invitrogen，货号#65002）过夜孵育。充分洗涤磁珠，通过在洗脱缓冲液中煮沸洗脱结合蛋白。磁珠磁力去除，洗脱液存于-20°C。

患者或细胞系来源异种移植

肿瘤组织从提供书面知情同意的患者中获得，依据组织收集方案（犹他大学机构审查委员会IRB 89989和10924），经亨茨曼癌症研究所（HCI）IRB批准。NOD.Cg-Rag1tm1MomIl2rgtm1Wjl/SzJ（NRG）小鼠在HCI的无病原体设施中饲养。所有动物实验均按照犹他大学机构动物护理和使用委员会批准的方案进行，我们遵守了所有相关伦理法规。将患者和患者来源异种移植（PDX）肿瘤组织碎片（约15 mg）皮下植入NRG小鼠（杰克逊实验室）。培养细胞系并皮下注射入NRG小鼠。

小鼠使用吸入式异氟烷进行麻醉，切口部位交替使用酒精和碘伏消毒两次。整个手术过程中，小鼠置于37°C水循环加热垫上维持体温。手术前3分钟，在预定切口部位皮下注射局部麻醉剂（利多卡因，5 mg/kg）。用剪刀做一个小切口（3–4 mm），将肿瘤组织碎片（1–3 mm3）皮下植入。切口使用单个9 mm创口夹闭合，术后7至10天取出创口夹。整个手术过程大约持续2分钟。术后，小鼠在37°C加热垫上复苏后放回笼中。每隔一周两次用游标卡尺测量肿瘤的两个维度大小，并使用公式（长度 × 宽度2）/ 2计算肿瘤体积（单位：mm3）。肿瘤被采集后置于液氮中速冻。

体内药物治疗

在药物研究中，待小鼠肿瘤生长至一定大小（100–500 mm3）后，随机分组进行给药。小鼠每天在背部皮下注射一次WA-68（20 mg/kg，给药体积10 mL/kg）或溶剂对照（5%葡萄糖，用1N盐酸调节pH值）。皮下注射位置在背部轮流更换，以避免注射部位刺激。每隔一周两次测量肿瘤大小。

组织病理学

组织用4%多聚甲醛固定，经梯度乙醇脱水，石蜡包埋，切片厚度为10 μm，进行苏木精-伊红（H&E）染色。切片随机排列顺序并以盲法评估。

肿瘤核提取

将肿瘤在Covaris TT1组织匀浆管（Covaris，货号#520001）中粉碎，洗涤后在Buffer A中裂解（20 mmol/L HEPES pH 8.0，1.5 mmol/L MgCl?，10 mmol/L KCl，0.25% NP-40，0.5 mmol/L DTT，含2倍蛋白酶抑制剂混合物）。细胞核经离心收集后，在Buffer C中重悬（20 mmol/L HEPES pH 8.0，25%甘油，1.5 mmol/L MgCl?，420 mmol/L KCl，0.25% NP-40，0.2 mmol/L EDTA，0.5 mmol/L DTT，含2倍蛋白酶抑制剂混合物），并使用Dounce匀浆器（WHEATON）破碎。旋转30分钟后，以20,000 g离心30分钟分离核提取物。

密度梯度沉降和BAF丰度计算

将样品上样至含有11 mL 10%至30%甘油梯度溶液的Beckman管中，梯度液配制含有20 mmol/L HEPES（pH 8.0）、1.5 mmol/L MgCl?、200 mmol/L NaCl、0.2 mmol/L EDTA、0.5 mmol/L DTT及2倍蛋白酶抑制剂混合物。梯度液在SW41转子中以40,000 rpm离心20小时，温度为4°C。使用BioComp分级收集系统自动收集共24个组分，每个组分的样品经SDS-PAGE检测后进行Western blot分析。

Western blotting

Western blotting所用一抗详见补充表S1。蛋白质样品经SDS-PAGE分离后转至聚偏二氟乙烯膜上。膜在含5%脱脂奶粉的含Tween 20的Tris缓冲盐水（TBS-T）中封闭，随后与一抗过夜孵育。经TBS-T洗涤四次后，与HRP标记的种属特异性二抗孵育，再用TBS-T洗涤四次，最后使用SuperSignal West Dura Extended Duration底物显影（Thermo Fisher Scientific，货号#34076）。

LI-COR定量Western blotting

蛋白质样品在Novex 4%至20% Tris-甘氨酸微型凝胶上分离后，转至Protran硝酸纤维素膜上。膜用Sea Block封闭缓冲液（Thermo Fisher Scientific，货号#37527）封闭，随后在含0.1% Tween 20的PBS（PBST）中与一抗过夜孵育。用PBS-T洗涤三次后，膜与山羊抗小鼠或山羊抗兔荧光二抗（LI-COR Biosciences，货号#926-68071或货号#926-32210）孵育1小时。膜再用PBS-T洗涤四次，用PBS洗涤一次，然后通过LI-COR CLx成像系统检测。荧光Western blot信号使用Image Studio Lite v6.1软件进行定量分析。

重组GBAF复合体克隆

pFastBac1-CMV载体由犹他大学曹二胡博士提供。各GBAF亚基的cDNA分别在各自的缓冲液中使用Phusion DNA聚合酶或Pfu DNA聚合酶进行PCR扩增。扩增产物使用NEBuilder HiFi（New England Biolabs，#E2621L）亚克隆至pFastBac1-CMV中，并转化至化学感受态大肠杆菌top 10（实验室库存）。GBAF基因表达盒从PCR扩增产物通过NEBuilder HiFi组装至pBig1s中，具体方法如已发表方案所述（bioRxiv 2021.10.26.465931；参考文献23）。pBig2组装克隆转化至NEB Stable（New England Biolabs，#C3040H）或DH10B（Thermo Fisher Scientific，#EC0113）电感受态细胞中。

Expi 293表达GBAF复合体

pFastBac1-CMV-GLTSCR1与以下各质粒共转染，使用Expi293表达系统（Thermo Fisher Scientific，#A14524）：pBig2野生型（WT；SMARCA4、V5-SS18、2×SMARCC1、BCL7、BRD9、3×Flag-SMARCD1和ACTL6）、pBig2融合型（SMARCA4、V5-SS18::SSX1、SMARCC1、BCL7、BRD9、3×Flag-SMARCD1和ACTL6）、pBig2 WT ΔBRD9（SMARCA4、V5-SS18、2×SMARCC1、BCL7、3×Flag-SMARCD1和ACTL6）以及pBig2 Fusion ΔBRD9（SMARCA4、V5-SS18::SSX1、SMARCC1、BCL7、3×Flag-SMARCD1和ACTL6）。pBig2 WT和pBig2 Fusion质粒也在无pFastBac1-CMV GLTSCR1的情况下转染，以表达ΔGLTSCR1复合体。转染按Thermo Fisher ExpiFectamine 293方案进行瞬时转染。

重组GBAF纯化

转染后60至64小时收获瞬时转染的Expi 293细胞。细胞在4°C、500 × g条件下离心5分钟。细胞用冷1× TBS洗涤，再如上所述离心。以下所有步骤均在4°C进行。洗涤后的细胞重悬于Buffer A中（20 mmol/L HEPES pH 8.0，1.5 mmol/L MgCl?，10 mmol/L KCl，0.25% NP-40，0.5 mmol/L DTT，含蛋白酶抑制剂），在冰上孵育10分钟。使用Dounce匀浆器（Kontas和WHEATON）辅助裂解细胞膜。细胞核在4,500 RPM下离心10分钟收集，重悬于Buffer C中（20 mmol/L HEPES pH 8.0，25%甘油，1.5 mmol/L MgCl?，420 mmol/L KCl，0.25% NP-40，0.2 mmol/L EDTA，0.5 mmol/L DTT，含蛋白酶抑制剂）。通过Dounce匀浆和旋转30分钟辅助核提取。核提取物的可溶部分和不溶部分在20,000 g下离心30分钟分离。Anti-Flag M2亲和凝胶（Sigma-Aldrich，货号#A2220）在无DTT和蛋白酶抑制剂的Buffer C中平衡。核提取物的可溶部分与Anti-Flag树脂混合，旋转45分钟。Anti-Flag树脂在1,500 g下离心2分钟收集，然后分别用Buffer C洗涤2次、Flag洗涤液（20 mmol/L HEPES pH 8.0，15%甘油，300 mmol/L KCl）洗涤2次、Buffer G-50（20 mmol/L HEPES pH 8.0，50 mmol/L KCl，5%甘油，0.05% NP-40）洗涤2次。GBAF复合体从Anti-Flag树脂中以3×30分钟的梯度洗脱，洗脱液为Buffer G-50加0.5 mmol/L DTT和250 ng/μL 3×Flag肽（Sigma-Aldrich，货号#F3290）。合并洗脱组分，浓缩至0.8至3 μmol/L，使用Amicon Ultra-0.5离心滤器（100 kDa MWCO）。浓缩后的复合体经0.22 μm Spin-X柱（Corning Costar，#8161）过滤。GBAF复合体分装后，液氮速冻并于?80°C保存。

人核小体重塑实验

EpiDyne核小体重塑实验底物（货号#16-4101）购自EpiCypher。采用1至16分钟的时间序列格式观察GBAF复合体的滑动（重塑）活性。每个时间点收集等量的总反应体积。所有实验中GBAF与核小体的摩尔比为1:4。反应在25°C下于滑动缓冲液中孵育（10 mmol/L Tris pH 7.5，50 mmol/L KCl，3 mmol/L MgCl?，0.5 mmol/L DTT）。通过加入100 ng竞争性DNA和13 mmol/L EDTA终止各时间点反应。收集的时间点中加入甘油至终浓度10%，上样于4.5%聚丙烯酰胺凝胶。电泳缓冲液和凝胶均为0.4× Tris-硼酸-EDTA（TBE），110 V电泳50分钟。使用1 μg/mL溴化乙锭染色DNA，用Typhoon Trio（GE Healthcare）扫描图像进行定量分析。Image Studio软件用于测量凝胶扫描图中原始位置和滑动位置的密度。使用lme4 R包生成两个独立模型进行方差分析。这些模型采用线性混合模型效应结合时间样条来考虑原始图数据的渐近关系。模型中将技术重复和批次年份差异嵌套在生物学重复内以考虑变异性。第一个模型考虑了时间点与不同组别之间的交互作用，第二个模型省略了该关系。这一差异的统计学显著性P值为0.02531，说明GBAFWT和GBAFΔBRD9的曲线随时间存在差异。

核小体滑动滴定实验

滴定核小体滑动实验使用204 bp DNA片段，该片段含有中心定位的601强定位序列（参考文献24），通过PCR制备并经预制电泳纯化（PrepCell，Bio-Rad）4.5%（37.5:1）天然聚丙烯酰胺凝胶，恒定电压400 V运行，电泳缓冲液为0.5× TBE（45 mmol/L，pH 8，含1 mmol/L EDTA），洗脱缓冲液为TE（10 mmol/L Tris和1 mmol/L EDTA）。未修饰的单重组人组蛋白在大肠杆菌BL21-CodonPlus (DE3)RIL中表达，并以包涵体形式纯化，方法基本同先前所述（参考文献25）。H2A K119单泛素化组蛋白通过两种重组表达并纯化的蛋白质之间的二硫键定向化学连接制备：组蛋白H2AK119C和泛素- intein-His6融合蛋白，方法基本同先前所述（参考文献26），两种组分和最终产物均通过半制备反相高效液相色谱纯化并经质谱验证。组蛋白八聚体通过盐透析从单重组人组蛋白组装而成，方法基本同先前所述（参考文献25）。单核小体组装按先前方法（参考文献27）通过滴定反应完成，50 μL反应体系含40 pmol DNA片段（0.8 mmol/L）溶于2 mol/L KCl中，与可变量的组蛋白八聚体混合至等摩尔比，在冷条件下按先前方法（参考文献25）以线性盐梯度透析从2 mol/L降至50 mmol/L KCl，使用Econo Pump（Bio-Rad）和Slide-A-Lyzer MINI透析单元（7,000分子量截留，Thermo Fisher Scientific）。滴定滑动实验使用递增量的重塑酶（如图注所述），在10 μL反应体系中含200 fmol单核小体（20 nmol/L），于30°C下在ThermoMixer（Eppendorf）中以500 rpm振荡孵育，缓冲液条件为10 mmol/L Tris（pH 7.4）、50 mmol/L KCl、3 mmol/L MgCl?、0.1 mg/mL BSA和1 mmol/L ATP。反应通过加入200 ng竞争性DNA（过量的pBluescript质粒）终止，并继续在30°C、500 rpm振荡条件下孵育30分钟。样品以10%甘油上样至4.5%（37.5:1）天然聚丙烯酰胺凝胶，在0.4× TBE中恒定电压110 V电泳55分钟。凝胶在1 mg/mL溴化乙锭溶液中染色10分钟，在Typhoon Trio（Amersham，GE Healthcare）上扫描。

时间序列处理

HS-SY-II细胞在12、24、48和96小时时间点分别用DMSO或WA68进行时间序列处理。在每个时间点，收集细胞进行下游多组学分析，包括RNA测序（RNA-seq）、转座酶可及性染色质分析测序（ATAC-seq）和染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）。样品制备和文库构建按本方法部分所述进行。

RNA-seq

新鲜冷冻肿瘤组织在1 mL TRIzol试剂（Thermo Fisher Scientific）中使用Tissue Tearor（BioSpec）匀浆。向样品中加入200 μL异丙醇，短暂涡旋后离心。收集上清液，加入等体积乙醇。使用Direct-zol RNA Miniprep Kit（Zymo Research，#R1018）从制造商方案的第2步开始进一步纯化RNA。RNA-seq文库使用NEBNext Ultra II Directional RNA Library Prep Kit（含rRNA去除）制备（New England Biolabs），在Illumina NovaSeq平台上以2 × 150 bp配对末端方案测序，每个样品产生约25至3000万条reads。reads使用STAR（v2.7.11；参考文献28）比对至小鼠基因组（mm10）。

计数矩阵由featureCounts（v1.6.3；参考文献29）生成，差异表达分析使用DESeq2（v3.11；参考文献30）完成。错发现率（FDR）低于0.05的基因被认为是显著差异表达的基因。为了可视化，表达值被转换为正则化对数（rlog）计数。主成分分析（PCA）基于所选基因集的rlog转换表达数据的前两个主成分进行。该基因集的热图通过基于样本间欧氏距离的非监督层次聚类生成。

**融合检测**

基因融合事件使用Arriba（v2.5.0）配合上游比对工具STAR（v2.7.11）进行识别（参考文献31）。原始双端RNA-seq读段经接头和质量修剪（Trim Galore v0.6.10）后，使用STAR比对至人类参考基因组（hg38），并启用嵌合读段检测功能。提供GENCODE v43的参考基因模型以支持剪接感知比对。在融合检测前，移除了PCR重复读段、次级/辅助比对、rRNA/mtRNA以及映射到ENCODE黑名单区域的读段。Arriba在STAR比对文件（Aligned.out.bam）及STAR嵌合连接输出（Chimeric.out.junction）上运行。提供了Arriba推荐的黑名单（rRNA、线粒体、免疫球蛋白/T细胞受体位点、通读和反复出现的技术假象）以及已知融合目录，以减少假阳性并注释反复出现的致病变异事件。功能注释（癌基因/抑癌基因状态、结构域保留情况和框内状态）取自Arriba的注释并与基因模型进行交叉验证。使用整合基因组浏览器对高置信度事件进行目视检查，以确认断点支持和伙伴基因的表达。

**ChIP**

ChIP-seq按照我们之前发表的方案进行。肿瘤在Covaris TT1组织研磨管（Covaris，#520001）中进行研磨。肿瘤沉淀物用1%甲醛交联，并用0.125 mol/L甘氨酸终止。在冷PBS中洗涤三次后，在温和裂解缓冲液（10 mmol/L Tris-HCl pH 8.5，10 mmol/L NaCl，含蛋白酶抑制剂的0.5% NP-40，PI，Sigma-Aldrich）中使用Dounce匀浆器分离细胞核，随后用洗涤缓冲液（10 mmol/L Tris-HCl pH 8.5，200 mmol/L NaCl，1 mmol/L EDTA，含PI的1% SDS）洗涤。细胞核在裂解缓冲液（50 mmol/L Tris-HCl pH 8.0，10 mmol/L EDTA，含PI的1% SDS）中裂解，随后用缓冲液（16.7 mmol/L Tris-HCl pH 8.1，16.7 mmol/L NaCl，1.2 mmol/L EDTA，1.1% Triton X-100，含PI的0.01% SDS）进行1:10稀释。随后使用EpiShear探针超声仪（Active Motif）对细胞核裂解液进行超声处理。向超声染色质中加入五微克一抗，在4°C下过夜孵育。第二天，100 μL预洗涤的Dynabeads混悬液（Thermo Fisher Scientific，#11204D）与免疫沉淀的染色质孵育4.5小时。经过一系列洗涤和逆转交联后，使用DNA Clean & Concentrator试剂盒（Zymo Research，#D4004）纯化DNA。使用NEBNext Ultra II DNA文库制备试剂盒构建测序文库，并在NovaSeq测序系统上使用2×150 bp方案（Illumina）进行测序，每样本约25至3000万条读段。原生ChIP-seq按照之前发表的方案进行。样本经裂解后由MNase消化。ChIP使用针对H3K4me1、H3K4me3、H3K27ac、H3K27me3、H3K36me3和H2AK119ub的经验证抗体进行。DNA逆转交联、纯化并测序。使用Novoalign（v3.00）将读段比对至mm10小鼠基因组版本的双端读段。使用MACS2（v2.2.9）以以下参数从每个比对后的bam文件相对input读段中调用峰值：callpeak -B –SPMR –q value = 1e?3 –mfold 15 100（参考文献32）。ChIP input作为MACS2的背景。使用MACS生成归一化的bedgraph，随后转换为bigWig文件。对位于黑名单中的峰值（包括ENCODE黑名单区域）进行过滤去除。所有下游分析中使用samtools rmdup去除重复读段。对每个条件中多个重复的bigWig富集文件进行平均方式合并，随后进行读深归一化。使用deepTools（v3.5.6；参考文献33）中的plotHeatmap函数生成展示对应基因组区域分数热图和轮廓图。在生成热图之前，先使用computeMatrix函数计算每个基因组区域的分数。使用deepTools套件中的multiBigwigSummary函数进行各种ChIP-Seq数据集的相关性分析，特别关注Brg1结合位点。使用皮尔逊相关系数来量化数据集之间关系的强度和方向。

为了比较载体处理和dBRD9处理的STG048 PDX样本之间的H2AK119Ub ChIP-seq信号，我们首先识别并校正了两个条件之间的系统性批次效应。我们认为，H2AK119Ub峰值与H3K27me3共同占据的区域应基本不受BRD9降解的影响，因为这些代表经典的PRC1/PRC2共结合位点，其中泛素化独立于BAF复合体活性而维持。使用MACS2/MACS3分别为两个生物学重复调用H3K27me3广泛峰值（REP1：107,421个峰值；REP2：84,793个峰值）。通过bedtools intersect（-wa -u）取两个峰值集的交集，保留存在于两个重复中的峰值，得到56,300个可重复的H3K27me3峰值。61,480个Ub独特峰值（不重叠SS18–SSX融合结合位点的H2AK119Ub峰值）通过bedtools intersect（-wa -u）与可重复的H3K27me3峰值进行交集，得到23,956个Ub + H3K27me3共占据峰值作为不变参考位点。使用deeptools multiBigwigSummary（BED文件模式）对各自bigWig文件中的两个条件在所有23,956个不变参考峰值上量化平均H2AK119Ub信号。对每个区域的信号值取平均，获得在这些对照位点上载体平均信号为0.1221，dBRD9平均信号为0.0863，比例为载体/dBRD9 = 1.414，随后使用deeptools computeMatrix（参考点模式，以峰为中心，±5 kb窗口）和computeMatrixOperations cbind将其应用于SAT位点的H2AK119ub ChIP-seq富集。最后，使用deeptools plotHeatmap和plotProfile可视化合并矩阵，使用匹配的颜色比例尺（白色至皇家蓝；zMin = 0；zMax = auto），并按载体样本信号降序排序。

**ATAC-seq**

ATAC-seq按照张实验室的Omni-ATAC方案进行。细胞（50,000个）沉淀后，用含0.1% NP-40、0.1% Tween 20和0.01%次硝酸铋的50 μL冷ATAC-RSB（10 mmol/L Tris-HCl pH 7.5，10 mmol/L NaCl，3 mmol/L MgCl?）重悬，在冰上孵育3分钟。裂解后用含0.1% Tween 20的1 mL冷ATAC-RSB冲出。离心后，细胞沉淀用50 μL转座混合液重悬[25 μL 2× TD缓冲液，2.5 μL转座酶（Illumina，#20034198），16.5 μL PBS，0.5 μL 1%次硝酸铋，0.5 μL 10% Tween 20，5 μL H?O]，在热混仪中以37°C、1000 rpm混合条件下孵育30分钟。使用DNA Clean & Concentrator试剂盒纯化标签化DNA。ATAC-seq数据使用nf-core/atacseq流程（v2.1.2，Nextflow v22.10.6）进行处理。原始双端FASTQ读段（150 bp）使用FastQC v0.11.9进行质量检查，并使用Trim Galore v0.6.7（cutadapt后端）进行接头修剪。读段使用Burrows-Wheeler Aligner MEM2 v2.2.1比对至GRCh38参考基因组（参考文献34）。比对结果使用SAMtools v1.15.1（参考文献35）排序和索引，并使用Picard MarkDuplicates v2.27.4去除PCR/光学重复。过滤线粒体读段、质量低于30的低质量比对读段和次级比对。通过正/反向链分别偏移+4/?5 bp校正Tn5插入偏好。使用MACS2 v2.2.7.1的双端模式（BAMPE）调用峰值。使用deepTools v3.5.1生成全基因组信号轨道，产生归一化bigWig覆盖文件——采用每千碱基每百万比对读段标度——以及转录起始位点（TSS）为中心的轮廓用于可视化。

**Visium空间转录组学**

Visium空间转录组学使用10x Genomics Visium空间基因表达平台按照制造商的方案进行。简要而言，福尔马林固定石蜡包埋组织切片（约5 μm厚）被粘附到Visium空间基因表达切片上并固定，随后进行H&E染色以进行组织学成像。组织切片随后进行通透化处理以释放mRNA，由切片表面的空间编码寡核苷酸捕获。进行逆转录生成带空间标记的cDNA，随后进行第二条链合成和cDNA扩增。按照标准方案构建测序文库并在Illumina平台上测序。原始测序数据使用Space Ranger流程（10x Genomics）处理，将读段比对至参考基因组并生成带空间坐标的基因表达矩阵。下游分析，包括归一化、聚类和可视化，使用Squidpy（v1.8.1；参考文献36）完成。

**统计分析**

对于两组独立样本均值的比较，我们使用双尾Student t检验，由GraphPad Prism软件（v9.0）实现。我们设定的统计学显著性标准为P值小于0.05或0.01，具体标准在各图注中相应说明。所有数据以均值±标准差表示。样本量的确定以预实验观察到的变异性为指导。值得注意的是，图注中引用的n值对应生物学重复的次数而非同一标本的重复测量。我们根据需要使用了额外的统计方法，具体分析细节在各图注中注明。此外，基因组数据相关的统计方法在方法部分的相应分析小节中详细说明。对于不满足正态性假设的独立组间比较，采用非参数Kruskal-Wallis H检验评估统计学显著性。Kruskal-Wallis H检验显示显著结果后，使用Dunn检验进行事后分析。采用Bonferroni校正调整显著性水平。

**结果**

**间叶性肉瘤中BRD9依赖性有限**

在DepMap和DRIVE上报告的BRD9耗竭在间叶性肉瘤细胞系中的生长抑制百分比是有限的，与通过SS18靶向CRISPR gRNA或shRNA耗竭融合本身相比尤为如此，但两者相对于其他细胞系而言对间叶性肉瘤细胞系而言都是相对较强的依赖性（图1A和B）。shRNA干扰实验强烈耗竭了BRD9，但不完全限制增殖，最明显地体现在集落形成实验中（图1C–E；补充图S1A–S1F）。BRD9耗竭一致地诱导了部分细胞周期阻滞，细胞群体向非增殖G2期偏移（图1F）。虽然BRD9耗竭后细胞增殖抑制和集落形成能力的改变并非所有与间叶性肉瘤无关的对照细胞系所共有（这促使BRD9被提升为间叶性肉瘤特异性依赖性），但BRD9耗竭对间叶性肉瘤细胞的影响并不像融合癌蛋白本身耗竭那样显著（补充图S1G–S1K）。在两种间叶性肉瘤细胞系来源的异种移植（CDX）体内实验中，尽管BRD9持续且强烈耗竭，但增殖受限导致生长减缓而非停止（图1G–K；补充图S1L–S1N）。这与在耗竭SS18::SSX融合癌蛋白的CDX中观察到的肿瘤消退形成对比（图1L）。

**图1.** BRD9是间叶性肉瘤中一致但有限的依赖性。A，DepMap门户上通过RNAi在间叶性肉瘤细胞系（圆点）和其他对照细胞系中测试的BRD9和SS18依赖性的直方图。B，DepMap门户上通过CRISPR/Cas9靶向的类似依赖性。C，Western blot显示在人SYO-1细胞系中用两种Dox诱导型shRNA在100 ng/mL Dox和1 μg/mL嘌呤霉素处理5天后的BRD9耗竭效率。D，shBRD9与shControl在Dox诱导后培养10天的细胞活力。E，SYO-1细胞在BRD9耗竭与对照处理10天后的结晶紫染色集落形成实验。F，流式细胞术显示HS-SY-II间叶性肉瘤细胞群体在BRD9耗竭后与各种对照相比的细胞周期分布。G，转染shControl或针对BRD9的两种shRNA之一的SYO-1细胞异种移植生长情况，各组均带或不带Dox诱导。H，qRT-PCR确认Dox处理的异种移植中BRD9 mRNA在早期和晚期的耗竭。I，转染非靶向（NT）对照或BRD9靶向shRNA的HS-SY-II细胞异种移植生长情况，各组均带或不带Dox给药。J，Dox诱导的shRNA在HS-SY-II异种移植中早期和晚期确认BRD9 mRNA耗竭。K，BRD9耗竭或对照处理后Ki-67 IHC显示的增殖情况。L，转染靶向融合癌蛋白SS18::SSX连接序列的Dox诱导型shRNA的HS-SY-II细胞异种移植生长情况，用Dox或溶剂对照处理。

等方差t检验，*，P < 0.05；**，P < 0.005；***，P < 0.0005。图1：BRD9在滑膜肉瘤中是一致但有限的依赖性。A，通过RNAi在滑膜肉瘤细胞系（点）和其他对照细胞系（DepMap门户中的柱状图）中分别测试对BRD9和SS18的依赖性。B，DepMap门户中通过CRISPR/Cas9靶向获得的类似依赖性。C，Western印迹显示在100 ng/mL Dox和1 μ/mL嘌呤霉素处理5天后，两种Dox诱导的shRNA对人工SYO-1细胞系中BRD9的耗竭效率。D，通过Dox诱导，shBRD9与shControl在培养10天后的细胞活力。E，BRD9耗竭与对照相比，SYO-1细胞在第10天的集落形成实验的结晶紫染色。F，流式细胞术显示BRD9耗竭后HS-SY-II滑膜肉瘤细胞群体的细胞周期分布，与多种对照相比。G，转染shControl或两种针对BRD9的shRNA之一的SYO-1细胞异种移植瘤生长情况，每种均带有或没有Dox诱导。H，qRT-PCR确认了在Dox处理的异种移植瘤中早期和晚期BRD9 mRNA的耗竭。I，转染非靶向（NT）对照或BRD9靶向shRNA的HS-SY-II细胞异种移植瘤生长情况，每种均带有或没有Dox给药。J，确认了Dox诱导的shRNA在HS-SY-II异种移植瘤中早期和晚期BRD9 mRNA的耗竭。K，BRD9耗竭或对照后Ki-67 IHC显示增殖情况。L，转染针对融合癌蛋白SS18::SSX连接序列的Dox诱导shRNA的HS-SY-II细胞异种移植瘤生长情况，给予Dox或载体对照处理。等方差t检验，*，P < 0.05；**，P < 0.005；***，P < 0.0005。图1关闭。

图2：一种新的PROTAC降解剂特异性针对BRD9

为开发针对BRD9的双功能降解剂，我们最初通过亲和基质下拉实验评估了已发表的溴结构域抑制剂BI-9564（37）的特异性。将溴结构域弹头KZL182与核裂解物共孵育，显示其对BRD7、BRD8和BRD9具有选择性结合（图2A和B），同时保留与其各自相关因子PBRM1、MORF和GLTSCR1的相互作用。然而，将此配体整合到CRBN结合的PROTAC中时，仅选择性降解了BRD9（图2C–E；补充图S2A），与另一种先前描述的PROTAC（38）类似。CRBN-化合物-BRD9三元复合物的预测建模表明，WA-68中的连接子与BRD9溴结构域之间的特异性相互作用归因于溴结构域ZA环中的甘氨酸159残基（补充图S2B和S2C；参考文献39）。相比之下，在BRD7的同源位置，丙氨酸154会与WA-68发生范德华碰撞，从而干扰BRD7的活性。WA-68在多种细胞环境中表现出对BRD9的强效且靶向的降解作用，但仍然只是温和地抑制增殖，并未普遍引发强烈的凋亡或坏死（图2F和G）。WA-68在携带MV-4-11急性髓系白血病（AML）细胞全身异种移植瘤的小鼠中，经口服给药显示出合理 的药效动力学和药代动力学特征（补充图S2D）。

图2：开发一种强效的BRD9特异性PROTAC降解剂。A，KZL-182的化学结构，即WA-68上的溴结构域结合部分。B，KZL-182在SYO-1滑膜肉瘤细胞系中的化学蛋白质组学分析，比较两个独立实验的倍数变化富集，每个实验中化学药和对照DMSO的样本量均为n = 3。C，WA-68的化学结构。D，靶向质谱定量分析显示，对MV-4-11细胞施加100 nmol/L WA-68或对照DMSO 6小时后，肽段水平上溴结构域蛋白的相对丰度（中位数±标准差）。E，同一质谱分析在蛋白质水平的靶向蛋白质组学结果。F，在第6天的活力测定中，WA-68介导的BRD9降解降低了——但并未完全消除——滑膜肉瘤细胞系的增殖（n = 2，均值±标准误）。G，Western印迹确认了在药物可达浓度下，各种人工滑膜肉瘤细胞系中BRD9的耗竭。

图2关闭。

WA-68在体内对滑膜肉瘤疗效各异

在体内将WA-68给予携带MoJo和HS-SY-II滑膜肉瘤细胞系CDX的NRG小鼠，仅轻微抑制其生长（图3A和B；补充图S3A和S3B）。在携带患者来源的滑膜肉瘤异种移植瘤JC2621的小鼠中应用，仅实现中度抑制生长，但对STG017和STG048的抑制作用要强得多（图3C–E；补充图S3C和S3D）。组织学上，即使经过细胞减灭的肿瘤也缺乏坏死，仍然似乎由肿瘤细胞组成，不同异种移植瘤中从梭形细胞到圆形细胞或圆形细胞到更梭形的形态有细微变化（补充图S3E–S3I）。尽管这些PDX在正电子发射断层扫描（PET）成像上并未显示强烈的18F-氟脱氧葡萄糖摄取，但通过18F-氟胸苷（FLT）PET成像有效进行了观察，其中三个PDX中的每一个在短期WA-68治疗前后连续成像中显示出的增殖变化减少均优于对照（图3F；补充图S3J）。WA-68给药后停止治疗，PDX STG017和STG048实现了持久的细胞减灭（图3G和H）。JC2621 PDX在停止治疗后恢复更快的生长，但在延迟重新开始治疗后再次以减缓生长做出反应（图3I）。尽管三个PDX均源自年轻患者，但只有肿瘤JC2621来源的患者曾接受过先前治疗（在该情况下，复发肿瘤前接受柔红霉素和异环磷酰胺治疗，成功异种移植了复发肿瘤的样本）。据报道，大多数滑膜肉瘤细胞系的基因组复杂性相对于PDX较高。RNA-seq显示JC2621中的融合事件作为复杂性度量相比STG048有所增加（图3J）。

图3：WA-68在体内对滑膜肉瘤疗效各异。A，MoJo患者来源细胞系异种移植瘤在WA-68处理下的分数生长。B，用WA-68或载体处理的HS-SY-II异种移植瘤的生长曲线。C，用WA-68或载体处理的PDX JC2621的分数。D，STG017的分数PDX生长。E，STG048的分数PDX生长。F，根据每个滑膜肉瘤PDX在治疗前和WA-68或载体治疗9天后计算的总病变增殖（TLP）变化（来自等方差t检验的P值）。G，有限时间WA-68或载体治疗后PDX STG017的分数生长。H，有限时间WA-68或载体治疗后STG048的分数PDX生长。I，用WA-68或载体有限时间治疗PDX分数生长曲线，然后在一段无治疗期后重新随机化，以WA-68或载体进行第二次治疗。J，通过RNA-seq确定的两个PDX的Circos基因组融合图。等方差t检验，*，P < 0.05；**，P < 0.005；***，P < 0.0005；n.s.，无统计学意义。

图3关闭。

BRD9耗竭改变了BAF家族复合物类型的平衡

施加WA-68后全细胞裂解液的Western印迹确认，在滑膜肉瘤细胞系ASKA和HS-SY-II中BRD9强效耗竭（在对照细胞系FU-UR-1中较弱，这是一种具有与BAF无关的ASPSCR1::TFE3融合体的肾细胞癌细胞系），融合癌蛋白SS18::SSX无耗竭，以及PBAF组分BRD7、PBRM1和SMARCB1的细微减少（图4A）。在体内治疗的MoJo CDX中观察到类似现象（图4B）。重要的是，在AML细胞系的全细胞蛋白质组学分析中，BRD7未被WA-68降解（图2D和E；补充图S2A）。在滑膜肉瘤背景下，WA-68处理与其他滑膜肉瘤细胞系对照相比，这种对PBAF复合物组分的细微影响更难察觉。处理细胞系或PDX核提取物的甘油梯度分级后Western印迹显示，在多种滑膜肉瘤背景之间有几个一致发现（图4C；补充图S4A和S4B）。第一，在WA-68处理的滑膜肉瘤中注意到PBAF复合物丰度细微减少。第二，CBAF相对丰度细微增加也一致可检测到。这两项发现在SMARCB1 Western印迹中最为明显，该印迹指示该蛋白在两种大小复合物之间的相对分布（图4C；补充图S4A和S4B）。由于这两种复合物已被证明在滑膜肉瘤背景下可相互补偿（15），因此这些两种转变可能直接相互关联。第三，在GBAF区域的大小分级中，通过一般BAF组分Western（BAF155或SMARCC1）和融合癌蛋白免疫印迹仍鉴定出一个复合物。

图4：WA-68耗竭BRD9，但也降低PBAF水平并增加滑膜肉瘤中CBAF水平。A，在滑膜肉瘤细胞系ASKA和HS-SY-II以及对照细胞FU-UR-1（表达ASPSCR1::TFE3的肾细胞癌）中施加WA-68或对照后SS18::SSX、BRD9和PBAF组分BRD7、PBRM1和SMARCB1的Western印迹。B，Western印迹显示WA-68或载体对照治疗的CDX肿瘤中BRD9、SS18::SSX、BRD7和PBRM1水平。C，核提取物甘油梯度Western显示SMARCC1在ASKA细胞系中WA-68或载体应用后不同BAF家族复合物亚型（绿色，GBAF；青色，经典BAF；紫色，PBAF）大小分级中的分布，以及SMARCB1在PBAF和经典BAF之间的不同分布，WA-68后后者更多。

图4关闭。

GBAF组装不依赖于BRD9

针对GLTSCR1染色的梯度显示，在BRD9降解后，GBAF大小的复合物仍然存在，但在复合物大小上运行小一个分级，支持在BRD9缺失的情况下GBAF组装（图5A和B；补充图S5A和S5B）。

该假设通过重组组分特定的纯化GBAF组装体进行了直接测试，这些组装体在EXPI293细胞（一种HEK293衍生物人类细胞系）中表达产生，并用携带GBAF所有亚单位的BigBAC质粒进行转染（图5C-E）。通过带有3XFLAG标签的SMARCD1进行纯化后，考马斯蓝染色的SDS-PAGE和Western blot确认了组分的存在，结果表明尽管从表达质粒中排除GLTSCR1会导致纯化后的复合物中BRD9缺失，但排除BRD9并未阻碍GBAF的组装（图5F和G）。在HD-MY-Z人类霍奇金淋巴瘤细胞系（该细胞系在BRD9耗竭或过表达后均能良好生长）中进行了BioID实验，使用了两种构建体，每种均可被Dox诱导，一种在BRD9羧基末端融合了带有V5标签的BioID2，另一种融合在氨基末端（补充图S5C）。然后向每种转染细胞群体中添加生物素，在有无Dox的条件下分别进行。随后通过链霉亲和素免疫沉淀获取生物素化蛋白，并经质谱蛋白质组学分析，两种探针均鉴定出GLTSCR1（BICRA）是除BRD9本身外唯一显著富集的蛋白（补充图S5D）。这表明GLTSCR1是GBAF复合物中与BRD9紧密相互作用的唯一成员，这解释了为何从GBAF中排除GLTSCR1会阻止BRD9的掺入。图5. 查看大图 下载幻灯片 GLTSCR1而非BRD9是重组GBAF组装所必需的。A. JC2621 PDX在用溶剂或WA-68处理后核提取物甘油梯度中间分数的GLTSCR1和BRD9 Western blot，GBAF分数由绿线标示。B. ASKA细胞系核提取物经甘油梯度分级的Western blot。C. bigBAC重组GBAF表达系统入口质粒示意图。D. 用于变组分GBAF纯化的转染bigBAC质粒示意图。E. 含可变组分的GBAF示意图，包括或排除GLTSCR1、BRD9以及SS18或SS18::SSX。F. 纯化后的含WT SS18或融合SS18::SSX、包括或不含BRD9或GLTSCR1的重组GBAF的考马斯蓝染色。G. 纯化后的重组GBAF复合物的Western blot，确认各组分在特定排除后的存在或缺失。图5. 查看大图 下载幻灯片 GLTSCR1而非BRD9是重组GBAF组装所必需的。A. JC2621 PDX在用溶剂或WA-68处理后核提取物甘油梯度中间分数的GLTSCR1和BRD9 Western blot，GBAF分数由绿线标示。B. ASKA细胞系核提取物经甘油梯度分级的Western blot。C. bigBAC重组GBAF表达系统入口质粒示意图。D. 用于变组分GBAF纯化的转染bigBAC质粒示意图。E. 含可变组分的GBAF示意图，包括或排除GLTSCR1、BRD9以及SS18或SS18::SSX。F. 纯化后的含WT SS18或融合SS18::SSX、包括或不含BRD9或GLTSCR1的重组GBAF的考马斯蓝染色。G. 纯化后的重组GBAF复合物的Western blot，确认各组分在特定排除后的存在或缺失。 关闭 图5. BRD9耗竭对GBAF染色质分布影响甚微，但降低了富集度

接下来，我们测量了在缺乏BRD9条件下GBAF在染色质上的全基因组分布影响，考虑到BRD9可能在复合物定位中发挥作用。在滑膜肉瘤中，GBAF的一个强有力的分布功能由SSX尾部与组蛋白H2A第119位赖氨酸单泛素化（H2AK119ub）修饰的核小体酸性斑点的紧密结合所驱动。尽管H2AK119ub通常是一种抑制性（或预抑制性）标记，与另一种抑制性Polycomb标记——组蛋白H3第27位赖氨酸三甲基化（H3K27me3）相关联，但融合癌蛋白对其的吸引将GBAF复合物分布于滑膜肉瘤基因组中H2AK119ub标记的染色质上（图6A；补充图S6A）。在这一滑膜肉瘤背景下——存在一个明显强力的替代分布功能，该功能与决定WT GBAF分布的机制无关——在使用溶剂或WA-68处理后未观察到GLTSCR1或SS18::SSX的全基因组分布发生显著变化（图6B和C；补充图S6B和S6C）。融合蛋白和GLTSCR1继续在近端启动子和远端增强子区域共分布，这些区域通常以H2AK119ub为特征，但富集度有所降低（图6D-K；补充图S6D和S6E）。如果富集度的降低是由于GBAFSS18::SSX复合物丰度普遍减少或BRD9缺失导致对染色质的亲和力降低所致，那么预期低富集位点会频繁降至ChIP-seq信号的背景噪声中，不再满足峰值调用的阈值。与此预测形成鲜明对比的是，BRD9降解后的富集度降低并未减少相同严格阈值下调用的峰值数量，但确实降低了这些峰值的富集强度。这一点通过富集度变化在溶剂处理对照组中最高富集位点最为突出的现象得到了说明，表现为最富集位点在富集度图中的变化更大（图6L和M；补充图S6F和S6G）。图6. 查看大图 下载幻灯片 BRD9耗竭影响滑膜肉瘤中GBAF的染色质分布。A. STG048滑膜肉瘤PDX作为异种移植肿瘤发展出的单个肿瘤中SS18::SSX、H2AK119ub、GLTSCR1及其他组蛋白翻译后修饰的ChIP-seq皮尔逊相关系数热图，使用溶剂处理。B. STG048 PDX中WA-68与溶剂处理后合并GLTSCR1峰值的富集度点图。C. PDX中WA-68与溶剂处理后合并SS18::SSX峰值处SS18::SSX富集度点图。D. STG048 PDX经WA-68或溶剂处理后所有合并GLTSCR1峰值在近端启动子位置的富集度图。E. STG048中所有合并SS18::SSX峰值在近端启动子位置的富集度图。F. STG048中远端GLTSCR1的热图富集度图。G. STG048中远端SS18::SSX的热图富集度图。H. JC2621中近端GLTSCR1的热图富集度图。I. JC2621中近端SS18::SSX峰值的热图富集度图。J. JC2621中远端GLTSCR1的热图富集度图。K. JC2621中远端SS18::SSX的热图富集度图。L. STG048肿瘤中WA-68或溶剂处理后在聚类交叉GLTSCR1+SS18::SSX+H2AK119ub近端位点的GLTSCR1和SS18::SSX富集度热图。M. STG048肿瘤中WA-68或溶剂处理后在聚类交叉GLTSCR1+SS18::SSX+H2AK119ub近端位点的GLTSCR1和SS18::SSX富集度图。图6. 查看大图 下载幻灯片 BRD9耗竭影响滑膜肉瘤中GBAF的染色质分布。A. STG048滑膜肉瘤PDX作为异种移植肿瘤发展出的单个肿瘤中SS18::SSX、H2AK119ub、GLTSCR1及其他组蛋白翻译后修饰的ChIP-seq皮尔逊相关系数热图，使用溶剂处理。B. STG048 PDX中WA-68与溶剂处理后合并GLTSCR1峰值的富集度点图。C. PDX中WA-68与溶剂处理后合并SS18::SSX峰值处SS18::SSX富集度点图。D. STG048 PDX经WA-68或溶剂处理后所有合并GLTSCR1峰值在近端启动子位置的富集度图。E. STG048中所有合并SS18::SSX峰值在近端启动子位置的富集度图。F. STG048中远端GLTSCR1的热图富集度图。G. STG048中远端SS18::SSX的热图富集度图。H. JC2621中近端GLTSCR1的热图富集度图。I. JC2621中近端SS18::SSX峰值的热图富集度图。J. JC2621中远端GLTSCR1的热图富集度图。K. JC2621中远端SS18::SSX的热图富集度图。L. STG048肿瘤中WA-68或溶剂处理后在聚类交叉GLTSCR1+SS18::SSX+H2AK119ub近端位点的GLTSCR1和SS18::SSX富集度热图。M. STG048肿瘤中WA-68或溶剂处理后在聚类交叉GLTSCR1+SS18::SSX+H2AK119ub近端位点的GLTSCR1和SS18::SSX富集度图。 关闭 图6. BRD9耗竭增加GBAF的染色质重塑活性

令人好奇的是，Duplaquet等人报道在两种非小细胞肺癌细胞系中，使用FHD-609进行BRD9 PROTAC降解后，ATAC-seq信号有所增加（图7A；参考文献41）。因此，我们检测了在滑膜肉瘤背景下，尽管我们观察到GBAF和融合癌蛋白在靶位点的富集度降低，但BRD9降解后ATAC-seq信号是否得以保留。值得注意的是，在两种滑膜肉瘤细胞系中应用WA-68后，ATAC-seq信号得到了强力保留（图7B和C）。这种保留的染色质可及性（局部BAF重塑活性的主要结果）提示BRD9缺失后GBAF的染色质重塑活性可能有所增加，GBAF增强的酶活性补偿了靶位点占有率的降低。对肉瘤发生激活的转录（各细胞系中经溶剂处理后融合癌蛋白、GLTSCR1和H2AK119ub靶向的基因）的评估显示，应用WA-68后这些基因表达上调，而看家基因倾向于表达降低（图7D；补充图S7A）。少数被肉瘤发生沉默的基因在BRD9降解后表现出表达增加或恢复（补充图S7B），这可能归因于经典BAF水平的轻微恢复（7）。使用可变组分的重组复合物直接测试了缺乏BRD9的GBAF的重塑活性。这里，从复合物中排除BRD9增加了含WT SS18的GBAF以及含SS18::SSX的GBAF在使用未修饰核小体时的核小体滑动活性（图7E-G）。使用另一组WT或H2AK119ub修饰的重组核小体进行的额外滑动实验也证实，与核小体相比，在较低GBAF浓度下，缺乏BRD9的GBAF在中位位置表现出增加的滑动活性（补充图S7C）。接下来，我们在HS-SY-II细胞系中进行了时间序列研究，评估在DMSO对照处理与WA-68处理12、24、48或96小时后的ATAC-seq、针对融合蛋白和GLTSCR1的ChIP-seq以及表达变化的RNA-seq。引人注目的是，染色质开放在全基因组和已知靶基因处增加，在48小时达到峰值，然后在96小时回归到可能代表新稳态的水平。GLTSCR1 ChIP-seq富集度的耗竭遵循与ATAC-seq相同的（倒置）模式（图7H和I；补充图S7D和S7E）。然而，在该细胞系中已知SS18::SSX靶基因表达增加的趋势随WA-68暴露时间延长而上升，至96小时并未回落到较低水平（图7J）。图7. 查看大图 下载幻灯片 GBAF重塑酶在缺乏BRD9时滑动活性增加。A. Duplaquet等人（2024）报道使用FH-609 BRD9 PROTAC降解剂处理两种非小细胞肺癌细胞系后获得、保留或丢失的ATAC-seq峰值数量。B. SYO-1细胞经WA-68和溶剂处理后全基因组ATAC-seq在调用峰值处的热图。C. HS-SY-II细胞经WA-68或对照处理后全基因组ATAC-seq在调用峰值处的热图。D. SYO-1细胞中肉瘤发生激活转录（SAT）基因（由SS18::SSX、H2AK119ub和GLTSCR1启动子结合交集确定）在BRD9降解后的差异表达。E. 重组GBAF核小体滑动实验示意图。F. 滑动实验展示BRD9排除对GBAF滑动的影响（P值来自应用线性混合模型时间样条效应的ANOVA）。G. 滑动实验展示BRD9从GBAF+融合蛋白中排除产生相似方向影响。H. HS-SY-II细胞系中经对照DMSO或WA-68处理12、24、48或96小时后，在全基因组启动子近端ATAC-seq位点的ATAC-seq热图和GLTSCR1及SS18::SSX（通过HA标签）ChIP-seq的富集度图。I. 在预先确定的由H2AK119ub、GLTSCR1和SS18::SSX调用的峰值在近端启动子共定位的位点，称为SAT位点，进行相同分析。J. RNA-seq确定的差异表达基因集热图，该基因集定义为在SS18::SSX耗竭后表达减弱的基因，且其启动子附近有HA-SS18::SSX ChIP-seq富集度 [依据Banito等人（40）]。图7. 查看大图 下载幻灯片 GBAF重塑酶在缺乏BRD9时滑动活性增加。A. Duplaquet等人（2024）报道使用FH-609 BRD9 PROTAC降解剂处理两种非小细胞肺癌细胞系后获得、保留或丢失的ATAC-seq峰值数量。B. SYO-1细胞经WA-68和溶剂处理后全基因组ATAC-seq在调用峰值处的热图。

C. HS-SY-II细胞经WA-68或对照处理后的全基因组ATAC-seq热图，显示在已注释峰值位点的染色质开放性变化。

D. SYO-1细胞中BRD9降解后，由SS18::SSX、H2AK119ub和GLTSCR1启动子结合位点交集确定的肉瘤发生激活转录（SAT）基因的差异表达。

E. 重组GBAF核小体滑动实验的示意图。

F. 滑动实验展示BRD9缺失对GBAF滑动活性的影响（P值来自对带有时间样条的线性混合模型效应所进行的ANOVA分析）。

G. 滑动实验展示BRD9从GBAF+融合蛋白中缺失产生的类似方向性影响。

H. HS-SY-II细胞系经对照DMSO或WA-68暴露12、24、48或96小时后，全基因组启动子近端ATAC-seq位点处GLTSCR1和SS18::SSX（通过HA标签）的ATAC-seq和ChIP-seq热图及富集分析图。

I. 在预先由H2AK119ub、GLTSCR1和SS18::SSX已注释峰值的启动子近端共定位位点（称为SAT位点）定义的位点上的相同分析结果。

J. RNA-seq确定的差异表达热图，基因集定义为在SS18::SSX耗竭时表达降低且启动子附近存在HA-SS18::SSX ChIP-seq富集的基因[依据Banito等人（40）的研究]。

图7. 滑膜肉瘤中BRD9降解驱动经典融合靶基因的过表达

融合癌蛋白引起的转录变化被归因于两类GBAFSS18::SSX靶基因：通常获得转录的靶基因，以及通常（但非排他性地）失去转录的BAF缺失靶基因。在经WA-68或载体对照处理的滑膜肉瘤PDX中评估这两组基因，结果表明靶基因表达增加（与细胞系中ATAC-seq信号增强一致），同时部分通常沉默的基因有所恢复，且较少数的间接靶基因表达增加，提示存在一定程度的经典BAF恢复（图8A–C）。BRD9耗竭后融合靶基因未减少的发现引出以下问题：这些靶基因在融合蛋白富集和GLTSCR1富集于其启动子和环化增强子处减少的情况下，是如何增加表达的？我们接下来检验了以下假设：决定GBAFSS18::SSX分布的H2AK119ub水平，在这些高靶向位点可能略有降低，同时GBAFSS18::SSX（缺乏BRD9）的染色质重塑活性被解除抑制。确实，这些位点的H2AK119ub有所减少（图8D和E），即使在将H2AK119ub富集相对于不应受GBAF影响的对照位点（其中H2AK119ub核小体标记与PRC2的H3K27me3标记共存）进行归一化后也是如此。评估WA-68暴露后BRD9耗竭引起的整体转录变化发现，轴突导向基因（SS18::SSX直接靶基因集中已知的一组基因）表达增加（图8F）。空间转录组学也证实，WA-68处理的PDX在肿瘤组织中特异性地表现出这些靶基因表达增加（图8G）。最后，根据可用于GBAFSS18::SSX结合的自由H2AK119ub位点对PDX和细胞系进行排序，也大致对应了它们对WA-68的反应性（图8H；补充图S8A和S8B）。

图8. 滑膜肉瘤中增强的GBAF重塑增加了与H2AK119ub相关的转录，同时反常地减少了H2AK119ub富集。

A. STG048 PDX中WA-68与载体对照的RNA-seq差异表达（SAT基因是ChIP-seq中启动子同时被SS18::SSX、GLTSCR1和H2AK119ub绑定的基因）。

B. 非H2Aub/融合/GBAF靶基因（称为MAT的看家模式基因）在WA-68与载体对照后的差异表达。

C. 滑膜肉瘤载体处理细胞中沉默基因在WA-68处理后的差异表达。

D. STG048 PDX暴露于载体或WA-68后的差异H2AK119ub ChIP-seq富集图（每种条件n = 2，富集值已在共有的H3K27me3富集位点处进行H2AK119ub富集归一化，作为GBAF影响的对照）。

E. H2AK119ub组蛋白翻译后修饰机制的示意图。在正常细胞背景下，H2AK119ub通常与同一核小体上的Polycomb抑制性H3K27me3标记共存；在滑膜肉瘤背景下，这一标记驱动GBAFSS18::SSX的招募，后者消除抑制性H3K27me3并导致相关基因转录。当通过PROTAC或其他方式进行BRD9耗竭时，缺乏BRD9的GBAF重塑活性增强，导致更多核小体周转、H2AK119ub密度降低和GBAFSS18::SSX招募减少，但染色质开放状态得以维持（通过每个招募复合物更高的重塑活性实现），驱动相关基因表达维持或增加。

F. STG048（反应性更强）和JC2621（反应性较弱）PDX在WA-68与载体对照处理后RNA-seq差异表达的京都基因与基因组百科全书（KEGG）标志通路基因集富集分析。NES，标准化富集分数。

G. STG048的载体和WA-68处理PDX的空间转录组学热图，展示轴突导向肉瘤发生激活转录基因集的表达，显示WA-68处理肿瘤中肿瘤组织部分表达增加。

H. 反应性更强和反应性较弱的PDX及细胞系中H2AK119ub和H3K27me3 ChIP-seq已注释峰值的文氏图，显示不含有H3K27me3的H2AK119ub位点丰度随对WA-68反应性降低而减少。

图8. 讨论

融合癌蛋白SS18::SSX是滑膜肉瘤中特定遗传改变产生的产物，它使GBAFs纳入并重新分布到Polycomb标记的染色质位点，这些位点随后转变为活跃的致癌转录状态（7, 9）。合理推测，作为GBAF组分的BRD9在滑膜肉瘤细胞中被鉴定为依赖性基因。由于BRD9是GBAF中唯一缺乏冗余旁系同源物的特异性组分，在单基因筛选中预计SS18::SSX肉瘤发生可能依赖于BRD9。我们现在了解到，对BRD9的依赖性与其在滑膜肉瘤中参与精细调控的染色质重塑平衡有关，而BRD9降解扰乱了这一平衡。滑膜肉瘤中BRD9降解对BAF染色质表观遗传平衡的扰乱受到两个生物学的限制，我们在此观察到。首先，GBAF（包括纳入了SS18::SSX的GBAF）中BRD9的丢失对复合物组装没有明显影响（图5），在滑膜肉瘤背景下对复合物全基因组染色质分布的影响也仅是适度的（图6）。BRD9确实可能在其他背景下通过其对乙酰化组蛋白的亲和力来调节GBAF在染色质上的分布（42），但在滑膜肉瘤中，SS18::SSX的H2AK119ub结合尾端所起的分布功能超越了这一影响。最重要的是，GBAF中BRD9的丢失增加了染色质重塑滑动活性，并在GBAF靶向位点导致更开放的染色质状态（图7）。滑膜肉瘤背景下复合物在靶位点富集的细微减少，可能源于GBAF所结合的核小体局部丰度降低。这些结果促使未来研究工作检验BRD9特异性调控GBAF活性的机制。其次，我们在其他工作中已表明，GBAF在纳入融合癌蛋白后获得的致癌功能——分布到驱动靶基因转录激活的启动子和增强子——仅占SS18::SSX在滑膜肉瘤癌细胞中致癌转录影响的一部分（7, 15）。SS18::SSX对CBAF降解和错定位的影响很可能同样对致癌或维持癌细胞身份有贡献。融合癌蛋白的这种以CBAF为核心的功能独立于GBAF和BRD9，至少是直接独立的。当在滑膜肉瘤背景下BRD9被降解时，出现了PBAF耗竭和经典BAF丰度恢复的残余迹象，这些提示了SS18::SSX功能中非直接GBAF机制的存在（图4）。尽管主要BAF复合物（CBAF、PBAF和GBAF）调控染色质结构和功能的不同方面，我们观察到它们之间显著相互作用，特别是在滑膜肉瘤的背景下（7）。这些动态可能对于涉及BAF组分改变的相关疾病机制以及治疗干预具有重要意义。在滑膜肉瘤中，BRD9降解后PBAF丰度的增加被逆转，同时观察到GBAF活性的提升。我们推测，缺乏BRD9的GBAF复合物增强的重塑活性可能压过了BRD9完整的滑膜肉瘤背景下局部缺失的TSS结合和+1核小体重塑（7）。另一种解释是CBAF的轻微恢复驱动了这些+1核小体处对PBAF需求的降低。这种相互作用及其功能后果对未来研究至关重要。我们将BRD9降解后核提取物中CBAF水平细微增加归因于融合蛋白被招募位点处同样观察到的H2AK119ub水平降低（图8D和E），因为此前我们已鉴定出滑膜肉瘤背景下CBAFSS18::SSX与H2AK119ub在染色质分布上的冲突（7）。由于包含融合蛋白但缺乏BRD9的GBAF更激进地重塑泛素化核小体并扩大染色质局部开放范围（通过ATAC-seq检测），这可能降低了H2AK119ub稳态水平，也可能是在最靶向位点GLTSCR1和SS18::SSX富集减少的驱动机制（图6和7）。带有H2AK119ub的核小体滑动增加将减少（但不会消除）这一初始吸引表位——用于招募GBAFSS18::SSX的表位（43–45）。染色质开放（通过ATAC-seq检测）与GBAF分布减少之间存在明确关系，尽管具有悖论性，这进一步证实了这一观点（图7H和I）。我们进一步推测，即使这种组蛋白标记的细微减少也可能类似地减轻CBAF的破坏。BRD9耗竭后CBAF破坏的部分缓解似乎微妙地增加了CBAF复合物的丰度（图4），这可能驱动与GBAFSS18::SSX靶基因不同的转录变化（图7J和8）。与此一致，在H2AK119ub标记的启动子和增强子处活跃的GBAF，以及我们归因于部分CBAF恢复的其他变化，提供了一个新的框架，表明尽管BRD9和融合蛋白在同一位点发挥作用，但各自耗竭会对邻近这些位点的基因转录产生相反的效果，基于BRD9作为活性抑制性组分的角色（图7）。

BRD9在GBAF内的抑制功能，可能解释了为何在两项针对BRD9 PROTAC降解剂的临床试验中，尽管其有效且靶向地降解了BRD9（16, 17），却仍遭遇毒副作用且未能实现滑膜肉瘤的强效细胞减少。首先，毒副作用更可能来源于某种本身丰度稀少的复合物（如GBAF）功能的增强。其次，虽然BRD9降解和增强的GBAF重塑活性扰乱了融合靶基因处精细调控的染色质动态平衡，并普遍增加了这些融合靶基因的表达，但拥有更多此类靶基因及GBAF潜在活性位点的滑膜肉瘤对BRD9降解更为敏感（图8H）。值得注意的是，近期一项对大规模人类滑膜肉瘤队列进行的表观基因组学评估发现，这些融合重编程位点的数量与基因组复杂性及不良预后呈负相关（bioRxiv 2024.05.14.594262）。显然，临床试验中纳入的典型患者所患癌症几乎必然符合两个标准：首先，癌症已进展至转移或不可切除的原发肿瘤；其次，已对多种治疗线表现出耐药。在少数较大的队列中，滑膜肉瘤已被证实处于复发、难治或进展状态时，其拷贝数复杂性不断升高（bioRxiv 2024.05.14.594262；参考文献46, 47）。此外，由于滑膜肉瘤的初始治疗通常包含电离放疗和DNA嵌入或烷化化疗中的一种或两种——这些治疗均会产生DNA损伤——因此也可以预期，难治性肿瘤已从治疗暴露中获得了基因组复杂性（以拷贝数变异或突变的形式），从而允许获得继发性遗传改变的难治性疾病生长。因此，入选I期临床试验的滑膜肉瘤可能比我们测试的更敏感的人源异种移植模型（图3和图8）具有更高的基因组复杂性（以及更少的融合重编程H2AK119ub位点）。在不同细胞背景和重组系统中深入剖析BRD9在GBAF内功能细节的努力，对于滑膜肉瘤和其他疾病无疑是必要且值得开展的。BRD9降解释放了增强的GBAF重塑酶滑动功能这一事实，建议在其他疾病中也开发靶向降解策略，如急性髓系白血病、骨髓瘤、恶性横纹样瘤和非小细胞肺癌（12, 41, 42, 48, 49）。对于滑膜肉瘤而言，特别是，考虑在聚焦的新辅助治疗试验框架下可能更为合适，即在使用BRD9降解等融合特异性疗法进行短暂疗效测试后，再进行手术局部控制。类似于我们的FLT-PET的生物标志物可能提供治疗效果的早期证据。或者，一些人可能认为，迫切需要更好疗法的滑膜肉瘤患者不会从这种策略中受益，因为危险性较低的滑膜肉瘤最有可能成为这一方法的受益者。另一个选择是找到与BRD9降解联合使用的合适疗法。

**数据可用性**

基因组数据以处理后的文件形式在基因表达综合数据库中公开可获取，登录号为GSE328410、GSE328411和GSE328412，相应的人类隐私保护下的原始测序数据可在dbGaP上获取，登录号为phs004771.v1.p1。质谱数据可在PRIDE数据库获取，登录号为PXD079388和PXD079670。其他所有原始数据可向通讯作者请求获取。

**作者声明**

G. Hollingworth报告有专利WO2021/055295及其家族成员待批和已授权专利。T. Zoller报告有专利WO2021/055295及其家族成员待批和已授权专利。E. Halilovic报告在诺华公司任职并持有其股票。C.R. Clapier在研究期间报告获得NIH U54 CA231652-01、霍华德·休斯医学研究所（HHMI）和犹他大学核控制计划试点基金的资助。A.F. Whittaker-Tademy在研究期间报告获得NIH U54 CA231652-01的资助。Faheem报告在提交工作之外获得Skaggs奖学金的资助。T. Abrams报告在诺华公司任职并持有诺华公司股份。G.G. Galli报告为诺华制药有限公司的员工和利益相关者。H. Voshol报告在研究期间及提交工作之外从诺华公司获得个人费用。K.L. Diehl报告在研究期间获得NIH/国家普通医学科学研究所（NIGMS）的资助，以及在提交工作之外获得NIH/NIGMS和Skaggs基金会的资助。J.T. Yap报告在提交工作之外从联影医疗、Spectrum Dynamics、NexEos Diagnostics和IntegraConnect获得个人费用。W. Forrester报告有已授权的专利WO2021/055295。B.R. Cairns报告在研究期间获得HHMI的资助，以及在提交工作之外从Paterna Biosciences获得个人费用和非财务支持。其他作者未报告声明。

**免责声明**

本文内容完全由作者负责，不一定代表NIH的官方观点。

**作者贡献**

J. Li：调查，撰写—审阅与编辑。M.L. Nelson：调查，撰写—审阅与编辑。L. Li：形式化分析，可视化，撰写—审阅与编辑。X. Xia：调查，撰写—审阅与编辑。C. Stephan：调查，撰写—审阅与编辑。K. Modzelewska：数据整理，调查，撰写—审阅与编辑。G. Yu：调查，撰写—审阅与编辑。I. Mulford：调查，撰写—审阅与编辑。H. Srinivas：调查，撰写—审阅与编辑。X. Ge：调查，撰写—审阅与编辑。S. McCollum：调查，撰写—审阅与编辑。E.R. Jones：形式化分析，可视化，撰写—审阅与编辑。Y. Guo：调查，撰写—审阅与编辑。X. Chen：调查，撰写—审阅与编辑。G. Hollingworth：监督，撰写—审阅与编辑。T. Zoller：监督，撰写—审阅与编辑。E. Halilovic：监督，撰写—审阅与编辑。C.R. Clapier：调查，撰写—审阅与编辑。A.F. Whittaker-Tademy：调查，撰写—审阅与编辑。Faheem：调查，撰写—审阅与编辑。T. Abrams：监督，撰写—审阅与编辑。E. Harrington：监督，撰写—审阅与编辑。S. Gkountela：监督，撰写—审阅与编辑。G.G. Galli：监督，撰写—审阅与编辑。H. Voshol：监督，撰写—审阅与编辑。J. Thomas：监督，撰写—审阅与编辑。N. Carte：形式化分析，监督，方法论，撰写—审阅与编辑。X. Zhang：形式化分析，监督，方法论，撰写—审阅与编辑。K.L. Diehl：监督，方法论，撰写—审阅与编辑。D.H. Lum：数据整理，形式化分析，监督，方法论，撰写—审阅与编辑。M. Hirst：数据整理，形式化分析，监督，方法论，撰写—审阅与编辑。J.T. Yap：概念化，资源，数据整理，形式化分析，监督，方法论，项目管理，撰写—审阅与编辑。W. Forrester：概念化，资源，监督，资金获取，项目管理，撰写—审阅与编辑。B.R. Cairns：概念化，资源，监督，资金获取，撰写—原稿，项目管理，撰写—审阅与编辑。K.B. Jones：概念化，资源，监督，资金获取，调查，撰写—原稿，项目管理。

**致谢**

本文发表的研究所利用的资源包括犹他大学亨茨曼癌症研究所的高通量基因组学、临床前癌症模型、生物样本库与分子病理学，以及综合肿瘤学数据与工程共享资源。研究工作得到了L. B.和Olive S. Young癌症研究院士冠名讲席、亨茨曼癌症研究所细胞生长与分化核控制项目、亨茨曼癌症基金会以及NIH在资助编号R01CA201396、U54CA231652、R35GM143080和P30CA042014下的支持。

注：本文的补充数据可在Cancer Research在线（http://cancerres.aacrjournals.org/）获取。