KLF4 促进肺鳞状细胞癌中的 KRT13+ 丘状样状态

《Cancer Research》：KLF4 Promotes a KRT13+ Hillock-Like State in Lung Squamous Cell Carcinoma

　　

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## 摘要

肺鳞状细胞癌（LUSC）是肺癌的一种基底样亚型，治疗选择有限。尽管先前的研究已在鳞状肿瘤中鉴定出肿瘤增殖细胞（TPC）状态，但仍需进一步阐明LUSC肿瘤内异质性的更广泛格局。在本研究中，我们利用SOX2驱动的鼠模型、类器官培养和单细胞转录组分析来揭示LUSC内的细胞命运多样性，鉴定出一群KRT13+丘状样缓慢增殖肿瘤细胞，其特征为免疫调节基因表达特征。该肿瘤丘状样状态在多种动物和人类来源模型中保守存在，并且在大多数人类LUSC中通过计算预测得到确认，同时也存在于头颈部和食管鳞状肿瘤中。对肿瘤丘状样状态的细胞起源分析表明，肺克拉拉细胞产生具有管腔丘状样群体的肿瘤，而基底样TPC则转变为基底丘状样状态，类似于正常肺的谱系可塑性轨迹。在机制上，Kruppel样因子4（KLF4）促进KRT13+丘状样状态，并在体外有助于抵抗氧化应激和铂类化疗。总之，这些结果提供了关于LUSC肿瘤内异质性底层谱系可塑性的分子见解，为新的治疗策略提供了潜在途径。

**意义：** KLF4驱动一种缓慢循环的、KRT13+丘状样状态，该状态具有与基底谱系的可塑性，促进肺鳞状细胞癌的肿瘤内异质性，并在鳞状癌中保守存在，对治疗耐药具有潜在意义。

参见Tong和Ji的相关评论，第4455页。

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## 图形摘要

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## 引言

理解肿瘤异质性对于改善癌症治疗至关重要。肿瘤由多样化的癌症细胞、免疫细胞和基质细胞群体组成，癌症细胞可以通过遗传和非遗传因素（包括环境信号和表观遗传调控）采取不同的转录状态（1, 2）。单细胞RNA测序（scRNA-seq）的最新进展揭示了此前未被重视的癌细胞状态（3–5），然而驱动这些状态的机制及其对治疗耐药的贡献仍知之甚少。非小细胞肺癌约占美国肺癌病例的85%（6）。尽管靶向治疗改善了肺腺癌患者的预后，但肺鳞状细胞癌（LUSC）缺乏可操作的治疗靶点，使患者面临治疗选择有限的困境（7–10）。这些局限性可能反映了肿瘤内异质性和肿瘤细胞在不同表型状态之间切换的能力——即所谓的可塑性，这被认为是癌症的标志性特征和有效治疗的主要障碍（1, 2, 11, 12）。先前的研究在LUSC中鉴定出基底样肿瘤增殖细胞（TPC）（13–16），这与跨癌种的谱系可塑性一致（17–19）。基底细胞被认为是LUSC的潜在起源细胞（20, 21），维持气道上皮并在损伤后动态响应（22, 23）。鳞状肿瘤共享关键的基底标志物，包括ΔNp63和KRT5（6），加强了基底细胞生物学与LUSC发病机制之间的联系。然而，LUSC中是否存在从基底样TPC衍生而来的其他细胞状态仍不清楚。谱系追踪研究表明，基底细胞可以产生多种气道细胞类型，包括神经内分泌细胞、嗅细胞、离子细胞、克拉拉细胞、纤毛细胞和丘状细胞（4, 5）。其中，KRT13+丘状细胞已被鉴定为基底和克拉拉命运之间的过渡状态（4, 24）。近期的工作定义了两种丘状亚群：增殖性基底丘状细胞能够在损伤后重新填充气管上皮，以及保护性管腔丘状细胞，后者在转录上与分化的鳞状细胞相似，并维持上皮完整性（25）。癌症中是否存在类似的丘状样状态尚不清楚。基因工程小鼠模型（GEMM）在研究LUSC中发挥了重要作用（26–28）。尽管基底细胞被认为是最具生理相关性的起源细胞，但多种细胞类型均可导致LUSC（20, 29）。在小鼠中，基底细胞主要局限于气管，大多数GEMM依赖于远端肺细胞类型的转分化（26, 30–34）。尽管如此，小鼠鳞状肿瘤在分子和组织学水平上与人LUSC高度相似（13, 20, 26, 35, 36），为研究肿瘤内异质性和细胞状态调控提供了稳健的平台。Kruppel样因子4（KLF4）是一种转录因子，以情境依赖的方式调控增殖、分化和干细胞多能性（37, 38）。在皮肤和食管等分层上皮中，KLF4局限于上基底层，对于特定细胞类型的分化是必需的（39–42）。KLF4还与癌症有关——根据情境不同，可扮演致癌或肿瘤抑制的双重角色（37）。尽管KLF4与正常鳞状分化相关联，但其在LUSC和丘状细胞状态中的功能尚未得到探索。在此，我们研究KRT13+丘状样状态的细胞起源和转录调控，以定义肿瘤异质性的机制，为针对LUSC中被低估的细胞状态和转录可塑性的新治疗策略铺平道路。

## 材料与方法

### 基因工程小鼠模型（GEMMs）

Rb1^fl/fl^;Trp53^fl/fl^;Rbl2^fl/fl^（RPR2）、Rb1^fl/fl^;Trp53^fl/fl^;LSL-MycT58A-Ires-Luciferase（RPM；参考文献43）、Sox2-Ires-GFPL^SL/LSL^;Nkx2-1^fl/fl^;Lkb1^fl/fl^（SNL；参考文献26）、Lkb1^fl/fl^;Pten^fl/fl^（LP；参考文献13）和Kras^G12D^/+^;Trp53^fl/fl^（KP）小鼠此前已有描述。肿瘤起始和监测方法详见上述文献。以下启动子联合Ad5-Cre使用：RPM（10个Ad-CGRP-Cre诱导的肿瘤，5个Ad-CMV-Cre诱导的肿瘤）、RPR2（4个Ad-CGRP-Cre诱导的肿瘤，4个Ad-CMV-Cre诱导的肿瘤）、KP（8个Ad-CMV-Cre诱导的肿瘤）、LP（6个Ad-CMV-Cre诱导的肿瘤）和SNL（4个Ad-CMV-Cre和Ad-克拉拉细胞特异性启动子（CCSP）-Cre诱导的肿瘤）。所有小鼠均按照犹他大学和杜克大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）的规定饲养。在6至10周龄时，本研究的SNL小鼠经麻醉后，通过鼻内滴注1×10?个 plaque-forming units 的Ad5-CMV-Cre或Ad5-CCSP-Cre腺病毒进行感染（爱荷华大学）。病毒在生物安全2+级实验室中按照机构生物安全委员会的指南进行管理。所有动物实验均获得犹他大学或杜克大学IACUC的批准。使用雌性和雄性小鼠。未进行功效分析；使用的动物数量基于既往文献确定。

### 人类样本

人类肺癌组织微阵列（TMA）样本由E.F. Patz Jr.赠予。TMA样本已去标识化，仅提供经训练病理学家评分的组织病理学亚型信息。所有人类研究均按照美国联邦共同规则（45 CFR 46）和《贝尔蒙报告》的基本原则进行。人类肺癌患者的TMA样本是在杜克大学医学院机构审查委员会批准的方案下（方案编号：Pro00012914），经每位患者书面知情同意后制备的。TMA样本由另一名病理学家审核以确认组织病理学亚型并提供肿瘤百分比评分。肿瘤百分比为零的切片未进行分析。

### 细胞系

人支气管上皮细胞系BEAS-2B购自杜克细胞培养中心（Sigma，货号#95102433，RRID:CVCL_0168）。BCi-NS1.1细胞，一种永生化的人气道基底细胞干/祖细胞系，由康奈尔大学的Ronald Crystal博士制备并作为研究礼物提供（44）。两种经短串联重复序列（STR）分析的细胞系均使用支气管上皮细胞生长基础培养基（BEBM，Lonza，CC-3171）联合补充物和生长因子（Lonza，CC-4175）及0.2%青霉素-链霉素（Pen/Strep）在二维贴壁培养板中培养。传代时，用0.25%胰蛋白酶-EDTA（Gibco，25200056）使细胞脱落，用含15%胎牛血清的HEPES缓冲盐水溶液（CC-5024）淬灭，在4°C下250 g离心5分钟，然后用BEBM重悬后重新铺板。人LUSC细胞系NCI-H226（H226）和NCI-H520（H520）购自ATCC（CRL-5826，RRID: CVCL_1544和HTB-18，RRID: CVCL_1566，分别为）。ATCC进行STR分析和支原体检测，未进行进一步的细胞系鉴定。所有细胞系每3个月通过PCR检测支原体（iNtRON Biotechnology e-Myco VALiD PCR检测试剂盒，货号#25239）。细胞系培养不超过3个月。两种细胞系均在RPMI培养基（Gibco 11875093）中培养，补充10%胎牛血清、1% Pen/Strep和1% L-谷氨酰胺（200 mmol/L）。传代时，用0.25%胰蛋白酶-EDTA（Gibco 25200056）使细胞脱落，用培养基淬灭后重新铺板。

### 类器官

经FACS分选的SNL肿瘤细胞（NGFR?GFP?）在4°C下2,000 rpm离心5分钟，重悬于Matrigel中，在类器官培养基（OCM；50% DMEM/F-12补充10% FBS、1% Pen/Strep、1% L-谷氨酰胺、50 ng/mL EGF（Thermo Fisher Scientific，PHG031）和50 ng/mL FGF（Thermo Fisher Scientific，PHG0369）+ 50% L-WRN条件培养基（Wnt-3A、R-spondin 3和Noggin）+ 10 μmol/L ROCK抑制剂）中培养为三维穹顶。L-WRN条件培养基如前所述制备（45），使用L-WRN细胞（ATCC，CRL-3276）。传代或分选时，用冷DMEM破坏Matrigel穹顶，离心（1,500 rpm，5分钟，4°C），用PBS洗涤，用TrypLE（500 μL，15分钟，37°C）解离，用DMEM淬灭，然后在24孔板中用Matrigel重新铺板。所有细胞系和类器官每3至6个月通过PCR检测支原体（iNtRON Biotechnology e-Myco VALiD PCR检测试剂盒，货号#25239）。类器官培养不超过6个月。

### 收集组织用于类器官制备或单细胞测序

处死小鼠以收获携带肿瘤的肺组织或气管。为了分离肿瘤细胞，将携带肿瘤的肺组织取出放入冷DMEM（10% FBS、1% L-谷氨酰胺、1% Pen/Strep）中，用细剪刀机械切碎后，使用肺解离试剂盒（Miltenyi Biotec，货号#130-095-927）在37°C下按照制造商的说明进行进一步解离。值得注意的是，另一种使用70 kU/mL胶原酶I、50 kU/mL透明质酸酶、7.5 kU/mL DNase、2.5 U/mL胰蛋白酶和40 U/mL木瓜蛋白酶的组合解离方法，据报道已针对正常肺丘状细胞的回收进行了优化，因为用其他技术难以解离（25），但导致肿瘤细胞活力降低，因此未用于我们的单细胞制备。解离后的细胞用100 μm滤网过滤并收集到锥形管中。细胞在4°C下1,500 rpm离心5分钟沉淀，然后用氯化铵-氯化钾裂解缓冲液重悬以裂解红细胞。裂解反应用加入PBS淬灭，细胞离心。去除上清液，将携带肿瘤肺组织中的细胞重悬于FACS缓冲液（含2% FBS的PBS）中，用于后续流式分选和单细胞测序。

### 流式分选肿瘤细胞

来自携带肿瘤肺组织或肿瘤类器官的单细胞悬液（见"收集组织用于类器官制备或单细胞测序"和"类器官"）用兔抗-NGFR（Abcam，货号#ab8875，RRID: AB_306828；或Advanced Targeting Systems，货号#AB-N01AP，RRID: AB_171799）一抗在冰上孵育30分钟。然后用FACS缓冲液洗涤细胞，并在含荧光二抗（异硫氰酸荧光素标记的山羊抗兔IgG，Thermo Fisher Scientific，货号#A-10931，RRID: AB_2534068）和荧光偶联抗体（BV605-大鼠抗CD45，BioLegend，货号#103155，RRID: AB_2650656；用于肿瘤）的FACS缓冲液中染色。细胞在冰上避光孵育20至30分钟。孵育后，用FACS缓冲液洗涤并离心细胞。弃去上清液，将细胞重悬于含DAPI的FACS缓冲液中检测死细胞。然后使用细胞分选仪（BD Biosciences FACSAria或Beckman Coulter MoFlo Astrios）按照描述的设门方案进行流式分选。流式分选的肿瘤细胞用于scRNA-seq或在分选后30分钟内直接铺板类器官（见"scRNA-seq"或"类器官"）。对于用于测序的SNL Ad-CMV-Cre肿瘤细胞，GFP?和GFP?/NGFR?细胞在两个独立实验中分别测序。对于用于测序的SNL Ad-CCSP-Cre肿瘤细胞，GFP?细胞用于第一次测序（S1），GFP?、GFP?/NGFR?和CD45?细胞的混合物用于第二次测序（S2）。使用UltraComp eBeads Plus补偿微珠（Invitrogen，货号#01–3333-41）为NGFR一抗设置补偿。

### scRNA-seq

来自流式分选的GFP?和NGFR?GFP? SNL肿瘤或SNL肿瘤类器官的单细胞悬液按照10x Chromium平台方案（https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression）进行测序准备。分选GFP?的SNL Ad-CMV-Cre和Ad-CCSP-Cre诱导的肿瘤样品，以及SNL Ad-CMV-Cre GFP?/NGFR?肿瘤细胞在犹他大学亨茨曼癌症研究所高通量基因组学核心进行准备和测序。SNL Ad-CCSP-Cre混合物（GFP?、GFP?/NGFR?，S2）肿瘤样品和所有类器官样品在杜克大学内部准备，并由MedGenome进行测序。

文库制备采用Chromium单细胞3'基因表达(GEX)试剂盒，其中Ad-CMV-GFP+样品使用V2化学法(10x Genomics，货号#PN-120237)，而Ad-CMV-NGFR+GFP+、Ad-CCSP-GFP+、Ad-CCSP-NGFR+GFP+以及所有类器官样品使用V3化学法(10x Genomics，货号#PN-1000141)。简言之，根据制造商的说明，单个细胞被标记有16 bp的10x条形码，细胞特异性转录分子被标记有10 bp的唯一分子标识符(UMI)。逆转录试剂和10x凝胶微珠被装载在Chromium Chip G上(10x Genomics，货号#PN-1000136)，并放入Chromium单细胞控制器(10x Genomics，货号#PN-120263)中形成GEMs。在单个GEM内，根据制造商的建议，通过逆转录从捕获并标记的mRNA合成cDNA。随后，按照制造商的说明，对每个样品进行A尾添加、末端修复、接头连接和样品索引。所得cDNA文库在Agilent Technology 2200 TapeStation系统上使用Agilent D1000或D5000 ScreenTape进行评估，并使用KAPA Biosystems文库定量试剂盒(Roche，货号#070960140001)通过定量PCR进行定量。各文库经标准化后在Illumina NovaSeq 6000上进行测序，但Ad-CMV-GFP+样品例外，该样品在Illumina HiSeq上进行测序，采用10x推荐的读长，目标为每个细胞超过20,000条reads。

**10x scRNA-seq数据处理**

**去混叠和数据比对**

使用CellRanger对每个样品的reads进行去混叠和比对，以便进行下游分析。SNL样品的scRNA-seq数据首先使用10x cellranger mkfastq进行去混叠以生成fastq文件。然后，每个样品的reads被比对到GRCm38(mm10)小鼠基因组。对于SNL肿瘤类器官，reads被比对到包含fLuc、Venus、Cas9和eGFP序列的自定义小鼠基因组(GRCm38-mm10-2020-A；参考文献45)。使用cellranger count生成条形码和UMI计数。

**质量控制、数据合并和标准化**

所有聚类、细胞类型鉴定和质量控制(QC)均在Python(v3.8.8；RRID: SCR_024202)中使用Scanpy(v1.10.0)完成，遵循当前单细胞最佳实践的专家建议(46)。所有从Ad-CMV-Cre–或Ad-CCSP-Cre启动的肿瘤或肿瘤类器官中测序的细胞通过scanpy.read_10X_mtx()从过滤后的特征矩阵创建稀疏矩阵anndata对象进行读取，并使用scanpy.pp.calculate_qc_metrics()计算质量指标。通过选择线粒体含量≤15%的细胞，以及针对各样品类型分别应用以下标准来排除低质量细胞和可能的双细胞：SNL原发肿瘤样品中总counts>1,000且具有至少一个read的基因数在1,000至6,000之间的细胞，以及SNL肿瘤类器官样品中总counts>1,000且具有至少一个read的基因数在2,000至8,000之间的细胞。人患者数据来自Wu等人(47)，仅使用被鉴定为鳞癌的肿瘤，未进行额外QC过滤。头颈癌患者数据来自Kürten等人(48)，仅使用CD45?样品，并过滤总counts>500且具有至少一个read的基因数在500至4,000之间的细胞。食管癌患者数据来自Zhang等人(49)，仅使用被注释为上皮细胞的CD45?样品，未进行额外QC过滤。使用scanpy.pp.normalize_total()以目标总和10,000计算标准化counts。包含多个scRNA-seq数据集的整合anndata对象使用adata.concatenate()以join = "outer"进行合并。

**批次校正和聚类**

使用Scanpy(v1.10.0)和scVI-tools(v0.17.4)以及基准标准进一步处理数据，以在保持真实生物学变异的同时尽量减少批次效应，特别是跨整合对象(50)。具体而言，我们使用scvi.model.SCVI.setup_anndata()初始化来自包含所有样品和基因的拼接anndata对象的数据集整合和聚类，连续协变量键设为线粒体counts百分比，批次键标识在不同时间制备或测序的样品。模型以默认参数训练，早停耐心值为20，最大400个epochs，使用model.train()函数针对sc.pp.highly_variable_genes()函数确定的前10,000个高变基因进行训练。模型潜在表示通过model.get_latent_representation()获取，并添加到每个anndata对象的.obsm中。然后使用sc.pp.neighbors()计算邻居，use_rep设为从潜在表示添加到.obsm的类别。使用sc.tl.umap()且min_dist = 0.5执行均匀流形逼近和投影(UMAP)嵌入。最后，使用sc.tl.leiden()且分辨率设为1.0生成Leiden聚类用于初始步骤。在整个scVI流程中按要求，上述所有步骤均使用原始counts。每个数据集根据各聚类的n_genes_by_counts、总counts和线粒体counts百分比进行额外的QC和数据过滤。通常，模型倾向于将低质量和双细胞聚为一类，因此具有异常高或低平均genes_by_counts、总counts或线粒体含量的聚类被标记为低质量并考虑从数据集中移除。移除是在根据已知肿瘤和正常肺细胞的标志物基因评估基因表达，以及根据sc.tl_rank_genes_groups()确定的每个聚类的标志物基因后进行的，以帮助确保正常具有更高或更低n_genes_by_counts、total_counts或线粒体含量的生物细胞未被异常过滤掉。此外，从SNL原发肿瘤样品和人患者数据中，我们使用一组常见标志物基因鉴定并移除了非肿瘤细胞类型，包括免疫、内皮、成纤维和正常肺细胞类型。对于人患者数据，还根据已知在肺腺癌中高表达而在鳞状细胞癌中不表达的基因的表达移除了腺癌聚类。每次移除一个聚类后，我们在新anndata对象上迭代运行scVI流程经过此QC步骤，直到anndata对象中不再有低质量细胞聚类或非肿瘤细胞。此外，每次从更大的anndata对象中移除聚类后，都重新运行流程以优化聚类。最终Leiden聚类分辨率设置如下：人LUSC患者数据为1，SNL肿瘤类器官为0.75，SNL Ad-CMV和Ad-CCSP细胞合并为1，SNL Ad-CMV肿瘤细胞为0.5，头颈癌和食管癌患者数据均为0.5。最终Leiden聚类后，在高变基因上确定的嵌入被添加到包含所有基因原始read counts的anndata文件中。counts随后使用sc.pp.normalize_total()以target_sum = 1e4进行标准化，然后通过sc.pp.log1p()进行对数转换。单个基因的UMAP使用标准化counts生成，所有基因评分和差异表达基因(DEG)分析使用log转换后的counts进行。用于重现分析的源代码在GitHub上(https://github.com/TGOliver-Lab/Izzo_Hillock_2026)。

**基底层细胞、粘液性腺癌、花簇细胞和hillock细胞评分及相关性分析**

通用的hillock细胞评分是通过鉴定Montoro等人(4)和Plasschaert等人(5)数据集中Krt13+细胞富集的基因创建的，从而建立包含65个基因的"保守hillock特征"（在两个独立数据集中相对于其他正常肺细胞类型均具有保守性显著富集的基因）。"基底层评分"、"杯状细胞评分"、"俱乐部细胞评分"、"纤毛细胞评分"和"花簇评分"源自从小鼠气管分离的上皮细胞中进行的基于液滴的测序(4)。来自小鼠粘液性腺癌肿瘤的DEG排名列表（n = 1,137）中的前100个DEG被用于生成粘液性腺癌评分(51）。"基底层hillock评分"（n = 170）通过比较基底层hillock细胞与正常假复层肺上皮的DEG生成[log2折变（log2FC）> 0.5]，"管腔层hillock评分"（n = 335）通过比较管腔层hillock细胞与正常假复层肺上皮的DEG生成（log2FC > 0.5；参考文献25）。小鼠基因评分或人类基因评分使用Python中的Gprofiler(52)转换为各自物种的同源物。Hillock、基底层、粘液性腺癌、基底层hillock、管腔层hillock、杯状细胞、俱乐部细胞、纤毛细胞和花簇评分通过对表达数据转换为anndata对象并利用Scanpy中的scanpy.tl.score_genes函数在每个scRNA-seq文库的每个细胞上计算得出，在标准化和log转换数据上使用sc.pp.normalize_total()以target_sum = 1e4进行标准化，然后通过sc.pp.log1p()使用默认设置进行对数转换。

**CIBERSORTx**

CIBERSORTx是斯坦福大学Alizadeh和Newman实验室开发的一种工具，使用scRNA-seq表达数据输入来估计批量细胞群体（如批量肿瘤）中定义细胞类型的丰度(53, 54)。我们使用CIBERSORTx的交互式用户界面(https://cibersortx.stanford.edu)和Cell Fraction模块。自定义特征矩阵文件从单细胞参考样品文件构建，其中包含来自人鳞状细胞癌(SCC)肿瘤的标准化单细胞转录组数据（每位患者随机采样100个细胞；分析18例患者肿瘤；参考文献47）。每个细胞根据"hillock细胞评分"和"基底层评分"的阈值表达值被定义为"类hillock"或"非类hillock"（如上文所述：类hillock = z-score hillock_score ≥ 2，z-score basal_score ≤ 3）。来自肿瘤基因组图谱(TCGA)的LUSC肿瘤（n = 538个肿瘤）的批量RNA-seq数据作为输入混合物文件使用，置换次数设为50进行去卷积。细胞类型推断结果按"类hillock"细胞比例最高到最低的肿瘤排序。对LUSC TCGA肿瘤进行独立去卷积以确定KLF4-up评分高分比例（z-score KLF4-up评分 ≥ 2，z-score basal_score ≤ 3截止值如上所述使用）。最后，还使用已发表的白细胞LM22_Cibersort特征矩阵(53)对LUSC TCGA肿瘤进行独立去卷积，将每个LUSC肿瘤去卷积为22种免疫细胞类型。免疫细胞群体比例的确定方法是将每种细胞类型的丰度转换为总免疫群体的百分比，为避免除以零给每个值添加0.005（最低检测到的细胞百分比），计算比率，然后在绘图和与类hillock比例进行相关性分析之前进行log2转换。使用GraphPad Prism(RRID: SCR_002798)中的简单线性回归检验评估单个免疫细胞比例和"KLF4-up评分"高分比例与每个批量LUSC肿瘤中类hillock比例的相关性，CIBERSORTx图形也在其中生成。免疫细胞比例与类hillock比例的相关性使用Kendall tau-b检验确定，并使用Benjamini-Hochberg校正进行FDR计算。

**生存研究分析**

使用单基因(KRT13和KLF4)或基因集（前100个人类类hillock DEG和人类"KLF4-up"评分）的生存分析使用GEPIA2(55)进行，对TCGA-LUSC队列使用平均表达量截断值。对去卷积TCGA-LUSC数据的生存分析在GraphPad Prism中使用Mantel-Cox检验进行log-rank P值计算。患者被分为各自去卷积细胞状态中细胞比例最高的组（前25%）和最低的组（后75%）。

**KLF4-up评分计算**

"KLF4-up评分"（n = 51）通过取以下两者基因的交集生成：多西环素(doxy)处理与无doxy对照的比较中四氯唑反应元件(TRE)-KLF4表达BEAS-2B细胞上调节的基因（转换到小鼠同源物），以及sgKlf4i-1与非靶向对照sgRNA(sgNTCi)的比较中SNL肿瘤类器官下调节的基因（参见"BEAS-2B批量RNA-seq样品和数据处理"和"SNL肿瘤类器官"）。KLF4-up评分通过对表达数据转换为anndata对象并利用Scanpy中的scanpy.tl.score_genes函数在每个scRNA-seq文库的每个细胞上计算得出。

**滞育和高可塑性细胞状态评分计算**

滞育评分此前已被描述，源自小鼠胚胎发生阶段的比较，然后应用于癌症系统（方法参见Dhimolea等人；参考文献56）。高可塑性细胞状态(HPCS)评分此前已被描述，源自小鼠肺癌模型中的单细胞研究，然后应用于多种其他肿瘤类型（HPCS特征参见Chan等人；参考文献57）。这些评分通过对表达数据转换为anndata对象并利用Scanpy中的scanpy.tl.score_genes函数在每个scRNA-seq文库的每个细胞上计算得出。

**细胞周期相位计算**

细胞周期分析使用scanpy.tl.scores_cell_cycle函数进行。S期与G2-M期基因集源自Seurat中的cc.genes(58)并转换为小鼠同源物。每个细胞根据基因评分表达使用scanpy.tl.scores_cell_cycle函数分配细胞周期相位。

基因评分用于已分配细胞状态之间的统计比较，以比较 S 期和 G2–M 期中的预测种群。细胞状态分配和相关性分析

SNL 原发肿瘤的细胞状态通过评估 Leiden 聚类中的标志基因表达和基因特征评分来确定。细胞状态分配通过每个细胞状态的基因表达以及评估每个细胞状态与其他所有细胞相比的 DEGs（差异表达基因）进行了验证（参见“差异基因表达分析”）。对于患有肺鳞状细胞癌 (LUSC)、食管鳞状细胞癌 (ESCC) 和头颈鳞状细胞癌 (HNSCC) 的人类患者数据，通过确定“hillock-like"（hillock 样）阈值来分配细胞状态。计算 hillock 评分和基底评分的 z 分数，如果 hillock 评分的 z 分数≥2 且基底评分的 z 分数≤3，则确定细胞为"hillock-like"，这排除了高度基底样细胞，同时保留了与整体细胞群相比 hillock 基因表达较高的细胞。相关性分析使用 Scanpy 中的 sc.tl.dendrogram 和 sc.pl.correlation_matrix 函数执行，采用默认参数和 Pearson 方法。

差异基因表达分析

所有样本的 DEGs 使用 Scanpy 中的 scanpy.tl.rank_genes_groups 函数确定，使用 Wilcoxon 秩和检验对对数转换后的数据进行分析。该测试将每个组与其他所有组进行比较，以确定特定细胞群中的顶级 DEGs。对 SNL 小鼠肿瘤细胞类型（基底样 vs. 其他所有，基底 hillock 样 vs. 其他所有，腔面 hillock 样 vs. 其他所有）中上调的前 500 个基因 (DEGs)、人类肿瘤细胞类型（基底样 vs. hillock 样）中的 500 个基因以及类器官（基底样 vs. hillock 样）中的 500 个基因进行了 Enrichr 分析 (59)。对于来自 Montoro 及其同事 (4) 的正常 hillock 基因的 Enrichr 分析，如果 log2FC ≥ 0.5，则包括 hillock 细胞的 DEGs，并且包括来自 Plasschaert 及其同事 (5) 的所有 Krt13/Krt4 富集基因。

细胞表面蛋白编码基因的差异基因表达分析

所有样本的 DEGs 使用 Scanpy 中的 scanpy.tl.rank_genes_groups 函数确定，使用 Wilcoxon 秩和检验。然后使用细胞表面蛋白图谱 (Cell Surface Protein Atlas) 的小鼠或人类细胞表面蛋白列表 (60) 结合人类计算机模拟细胞表面蛋白图谱（SURFY 定义的所有预测表面蛋白；参考文献 61）用于人类，或将 SURFY 列表转换为小鼠直系同源物用于小鼠，对基因进行过滤。

CUT&RUN 样本处理和分析

如“类器官”部分所述，将 SNL 肿瘤类器官收集成单细胞悬液并重新悬浮于 OCM 中。使用 Cutana CUT&RUN 方案版本 2.1 (EpiCypher) 进行 CUT&RUN。简而言之，每个 CUT&RUN 反应使用 500,000 个类器官细胞，用含 0.05% 皂苷的洗涤缓冲液 (Wash Buffer) 洗涤，与活化的 ConA 磁珠 (EpiCypher, 货号 #21-1401) 孵育，并过夜进行抗体结合 (抗 KLF4, R&D Systems, AF3158, RRID: AB_2130245, 0.5 μg; IgG, Cell Signaling Technology-CST, 2729S, RRID: AB_1031062, 0.5 μg)。使用 pAG-MNase 消化染色质；释放的 DNA 片段使用 Monarch Spin PCR & DNA Cleanup Kit (NEB, #T1135) 纯化。每个反应使用 5 纳克 DNA 作为输入，使用 NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit (New England Biolabs- NEB, #E7645S) 进行文库制备。文库在 NovaSeq 仪器上进行测序，150 bp 双端 reads，每个样本目标读数为 5 到 10M reads。我们在 anti-KLF4 CUT&RUN 中获得了超过 5M reads。原始测序 read 数据输入到 nf-core/cutandrun 流程 (版本 3.2.2) 中，使用默认参数并与小鼠 mm10 基因组 (https://doi.org/10.5281/zenodo.10606804) 比对。使用 SEACR (62) 进行峰值调用，并使用 HOMER (RRID:SCR_010881; 参考文献 63) 配合 mm10 参考小鼠基因组进行注释。在 Enrichr 分析之前，按蛋白编码和启动子转录起始位点注释对 SEACR 注释的峰值进行了过滤。标准的 nf-core/cutandrun.bigWig 输出文件用于在 Integrative Genomics Viewer 中进行基因组轨道可视化。

类器官中的 KLF4 调节

对于慢病毒 CRISPR 介导的抑制，将以下靶向 Klf4 的向导 RNA 克隆到催化失活的 Cas9 (dCas9) KRAB 载体 (Addgene, #71236, RRID: Addgene_71236; dCas9 KRAB; 参考文献 64) 中：sgKlf4i-1 (5′CGCGCC GCC GAC AGC CAC AG 3′), sgKlf4i-2 (5′ AGT GTC CCC CAC CGT TGT CG 3′), 和 sgNTCi (5′ ACC TGA TAC GTC GTC GCG TA 3′)。pLV hU6-sgRNA hUbC-dCas9-KRAB-T2a-Puro 由 Charles Gersbach 惠赠 (Addgene, 质粒 # 71236, RRID: Addgene_71236)。人类 KLF4 在肿瘤类器官中在 TRE 控制下过表达。在类器官中使用 1 μg/mL 的 doxy (多西环素) 诱导 KLF4 过表达。通过 Plasmidsaurus 验证并确认测序。对于敲低和过表达，使用经过序列验证的质粒产生低或高滴度的慢病毒。将 293T (RRID:CVCL_0063) 细胞用三质粒转染系统转染，包括慢病毒载体、pCMV-dR8.2 dvpr (RRID: Addgene_8455) 和 pCMV-VSV-G (RRID:Addgene_8454)，以生产低或高滴度病毒。对于高滴度慢病毒感染，类器官细胞如连续传代所述解离并重新悬浮于 0.5 mL OCM 中 [50% DMEM/F-12 培养基 (补充 10% FBS, 1% Pen/Strep, 1% L-谷氨酰胺) + 50% L-WRN 条件培养基 (含 Wnt-3A, R-spondin 3, 和 Noggin) + 10 μmol/L ROCK 抑制剂]，含有聚凝胺 (10 μg/mL) 和高滴度慢病毒。然后在 24 孔板中室温下以 300 g 离心 30 分钟。然后将类器官细胞重新悬浮于含病毒的培养基中，并在 4°C 下以 2,000 rpm 离心 5 分钟。在将类器官细胞重新悬浮于 Matrigel 中并铺板之前，移除并储存含病毒的培养基。然后 Matrigel 固化后，将含病毒的培养基加回到类器官细胞中。然后允许细胞生长 2 到 3 天，之后将培养基更换为含有 1 μg/mL 嘌呤霉素或 2.5 μg/mL 潮霉素 B，分别用于 dCas9-Krab Klf4 敲低和 TRE-KLF4 过表达构建体。

类器官生长测定

为了确定类器官生长速率的差异，首先将类器官解离成单细胞（参见“类器官”），然后通过 35 μm 滤器以确保单细胞。然后将类器官细胞接种在 48 孔组织培养板中 20 μL Matrigel 穹顶中，每孔加入 200 μL OCM 以覆盖穹顶。每 3 到 4 天更换一次培养基，对于用 doxy 处理的类器官（仅限 TRE-KLF4 和 TRE-GFP 类器官），每 48 小时添加新鲜 doxy。每天使用 4 倍物镜对孔进行成像，每孔拍摄八张图像以捕获整个 Matrigel 穹顶。使用 ImageJ (RRID:SCR_003070) 盲法计数类器官，通过组合八张图像中计数的所有类器官来确定每孔的类器官数量。如果整个栓子未在八张图像中捕获，则移除该孔。

类器官药物处理测定

为了确定药物处理下类器官生长速率的差异，首先将类器官解离成单细胞（参见“类器官”），然后通过 35 μm 滤器以确保单细胞。单细胞悬液在 OCM 中旋转条件下，用顺铂、紫杉醇或过氧化氢以指定剂量处理 15 分钟。然后将类器官细胞接种在 48 孔组织培养板中 20 μL Matrigel 穹顶中，每孔加入 200 μL 含药物的 OCM 以覆盖穹顶。3 天后将培养基更换为不含药物的 OCM。对于延长的顺铂处理实验，在顺铂处理后的第 7 天，用 TrypLE 处理单个孔以溶解 Matrigel，将类器官离心沉淀，然后在 20 μL 中重新铺板。使用 Incucyte 活细胞成像 (Sartorius) 确定融合度，使用 GFP 荧光来指示活的类器官（GFP 由 SNL 肿瘤类器官中的所有细胞表达）。对于 N-乙酰半胱氨酸 (NAC) 挽救实验，单细胞悬液用顺铂或载体处理 15 分钟，然后接种在 Matrigel 中。Matrigel 固化后，加入含有顺铂或载体并添加 NAC 的 OCM，与细胞孵育前 3 天，然后将培养基更换为不含药物或 NAC 的 OCM。

细胞系生长测定和药物处理

对于 NCI-H520 (RRID:CVCL_1566)、BEAS-2B (RRID:CVCL_0168) 和 BCi-NS1.1 (RRID:CVCL_T029) 细胞，将细胞接种在 96 孔板中，并使用 Incucyte 活细胞成像 (Sartorius) 监测融合度。对于 NCI-H226 (RRID:CVCL_1544)，将细胞接种在 96 孔板中，并使用 CellTiter-Glo 基于荧光的 ATP 检测测定 (Promega, #G7570) 与对照条件相比确定细胞生长。对于表达 TRE-GFP 或 TRE-KLF4 的细胞系，在铺板当天添加 doxy，并在每 2 到 3 天更换培养基时添加。对于药物处理，在铺板 1 天后以指定剂量添加顺铂或紫杉醇。

类器官的福尔马林固定

移除孔中的培养基，Matrigel 胶块用 PBS 洗涤一次后重新悬浮于 0.5 mL PBS 中。将重新悬浮的类器官用 10% 福尔马林固定过夜，然后转移至 70% 乙醇中。然后将固定的类器官在 2,500 rpm 下离心，用 PBS 洗涤两次，然后放入 2.5% 琼脂糖中进行包埋。将琼脂糖包埋的类器官放入 70% 乙醇中并提交进行石蜡包埋。

细胞系中的 KLF4 调节

对于慢病毒 CRISPR 介导的敲除，将以下靶向 KLF4 的向导 RNA 克隆到 lentiCRISPRv2 (Addgene, #52961, RRID: Addgene_52961; LCV2) 中：sgKLF4-2 (5′- TCC CCG CCG CCC CTA TGA2-3′) 和 sgKLF4-3 (5′- AAT TGG AGA GAA TAA2-3′)。对于 KLF4 过表达，进行 TRE-KLF4 的慢病毒感染。

T7 surveyor 测定

基因组 DNA 按照 QIAGEN DNeasy Blood and Tissue Kit (货号 #69504) 中的方案提取。提取后，使用以下序列引物对靶向基因组区域进行 PCR 扩增：

为了分离 LCV2 sgKLF4-2 的向导结合位点周围区域，使用了以下引物：LCV2 sgKLF4-2 FWD Primer-1: 5′ ACC AAG AGC CAC TGA ACG AG 3′, LCV2 sgKLF4-2 REV Primer-1: 5′ CCG GAT CGG ATA GGT GAA GC 3′, LCV2 sgKLF4-2 FWD Primer-2: 5′ GTG TAT GCC CGT GGT GCG A 3′, LCV2 sgKLF4-2 REV Primer-2: 5′ GAT GGG TCA GCG AAT TGG AGA 3′。sgKLF4-2 引物集 1 的预期条带大小为 620 和 300 bp，sgKLF4-2 引物集 2 的预期条带大小为 550 和 170 bp。两种引物集使用的 PCR 条件均为 98°C 30 秒，35 个循环：98°C 5 秒，69°C 10 秒，72°C 20 秒，接着 72°C 2 分钟，然后保持在 4°C。为了分离 LCV2 sgKLF4-3 的向导结合位点周围区域，使用了以下引物：LCV2 sgKLF4-3 FWD Primer-1: 5′ ATC TTT CTC CAC GTT CGC GT 3′; LCV2 sgKLF4-3 REV Primer-1: 5′ TTG ATG TCC GCC AGG TTG AA 3′; LCV2 sgKLF4-3 FWD Primer-2: 5′ CCA GCA CGT CAG TAT GTC GG 3′; 和 LCV2 sgKLF4-3 REV Primer-2: 5′ CGC GTA ATC ACA AGT GTG GG 3′。sgKLF4-3 引物集 1 的预期条带大小为 1,000 和 200 bp，sgKLF4-3 引物集 2 的预期条带大小为 250 和 1,000 bp。按照制造商的方案，使用 Q5 high-fidelity 2× master mix (NEB, 货号 #M0492) 进行 PCR。然后将 PCR 产物与 6× 上样缓冲液混合并在 2% 琼脂糖凝胶上电泳。对凝胶成像以确认正确的 PCR 产物大小。然后使用 QIAquick gel extraction kit (QIAGEN, #28706) 对 PCR 产物进行凝胶回收。使用 Biotek Synergy HT 酶标仪测量 DNA 浓度。使用 200 纳克凝胶纯化 DNA 进行内切酶反应。T7 surveyor 测定按照 NEB 的"Determining Genome Targeting Efficiency using T7 Endonuclease I"方案进行。简而言之，200 ng 凝胶纯化 DNA 在热循环仪中杂交，先 95°C 变性 5 分钟，然后从 95°C 退火至 25°C。然后将退火 DNA 在 37°C 下用 T7 内切酶处理 15 分钟。酶反应后，DNA 在 2% 凝胶上电泳并成像。

免疫印迹

如前所述制备总蛋白裂解液，通过 SDS-PAGE 分离，并转移至聚偏二氟乙烯膜上 (65)。膜在 5% 脱脂奶中封闭 1 小时，然后在 4°C 下与一抗过夜孵育。所有一抗均稀释 1:1,000，包括 KRT13 (Abcam, 货号 #92551, RRID: AB_2134681)、KRT5 (BioLegend, 货号 #905501, RRID: AB_2565050)、KLF4 (CST, 货号 #4038, RRID: AB_2265207)、CAS9 (Active Motif, 货号 #61798, RRID:AB_2793684)、HSP90 (CST, 货号 #4877, RRID: AB_2233307)、P21 (CST, 货号 #2947, RRID: AB_823586)、PITX1 (Novus, NBP1-88644, RRID: AB_11032242) 和 GFP (CST, 货号 #2956, RRID:AB_1196615)。膜在室温下用 Tris 缓冲盐溶液 -Tween 20 (TBS-T) 洗涤三次，每次 5 分钟。小鼠和兔辣根过氧化物酶 (HRP) 偶联的二抗 (1:5,000; Jackson ImmunoResearch, 货号 #711-035-152, RRID:AB_10015282 和货号 #115-035-205, RRID:AB_2338513) 在 5% 脱脂奶中室温孵育 1 小时，然后在室温下用 TBS-T 洗涤三次，每次 5 分钟。

膜条使用WesternBright HRP量子底物（Advansta）进行显色，并在Hyblot CL胶片（Denville Scientific, Inc.）上检测。

**免疫组化**

自体小鼠模型的肺组织通过向肺内灌注1× PBS进行制备。将各叶肺组织分离，在室温下用10%中性缓冲甲醛固定24小时，经PBS清洗后转移至70%乙醇中。福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织切片厚度为4至5 μm。染色时，组织经脱蜡、复水后，在压力锅中以0.01 mol/L柠檬酸缓冲液（pH 6.0）高温煮沸20分钟进行抗原修复。切片在3% H?O?中淬灭内源性过氧化物15分钟，随后在PBS/0.1% Tween-20（PBS-T）中的5%山羊血清中封闭1小时。切片在封闭液中与一抗孵育（5%山羊血清或SignalStain抗体稀释液，Cell Signaling Technology，货号#8112）。切片经PBS-T三次洗涤后，与二抗孵育1小时。对于所有非CST抗体，二抗为HRP偶联抗体（Vector Labs），以1:200稀释于PBS-T中使用。CST一抗则使用150 μL SignalStain Boost IHC检测试剂（RRID: AB_10544930; AB_10547893）进行检测。随后进行DAB显色，并使用自动化的Epredia ClearVue盖玻片系统封片。一抗包括1:250 KRT13（Abcam，货号#92551，RRID: AB_2134681）；1:2,000 KRT5（BioLegend，货号#905501，RRID: AB_2565050）；以及1:500 HNF4α（CST，货号#3113，RRID: AB_2295208）。人工H评分定量采用Pannoramic MIDI II全自动数字切片扫描仪（3DHistech）对整个切片进行扫描。免疫组化定量纳入所有采集肺叶中的所有SNL肿瘤，包括鳞癌和腺癌。H评分通过按0至3的等级评估每种抗体的染色强度，然后乘以表达该标记物的细胞百分比（KRT13?细胞百分比）来计算。例如，一个肿瘤中50%阳性细胞高强度（3级）和20%阳性细胞中等强度（2级），则H评分为190，标记阳性细胞为70%。对于人类组织TMA的免疫组化，染色方法如上所述。H评分对整个TMA斑点进行评估。被评为不含肿瘤的斑点从分析中排除。

**免疫荧光**

FFPE肺组织（见"免疫组化"部分）和类器官（见"类器官福尔马林固定"部分）按前述方法制备。染色时，组织经脱蜡、复水后，在压力锅中以0.01 M柠檬酸缓冲液（pH 6）高温煮沸20分钟进行抗原修复。TROP2染色采用相同方法，但抗原修复使用TRIS-EDTA缓冲液。切片在PBS-T中的5%山羊血清中封闭1小时；若使用小鼠来源的一抗，则使用M.O.M.试剂盒（Vector Labs，货号#BMK-2202）中的封闭液封闭1小时。切片经PBS-T三次洗涤后，在避光条件下与二抗孵育1小时。随后切片用PBS-T洗涤，在PBS-T中的DAPI中孵育1小时，最后用Fluoromount-G（SouthernBiotech，货号#0100-01）封片。一抗包括1:250 KRT13（Abcam，货号#92551，RRID: AB_2134681）、1:400 TRP63（R&D Systems，货号#AF1916，RRID: AB_2207174）、1:100 P40（Biocare，货号#ACI3066，RRID: AB_2858274）、1:200 Ki67（BD，货号#556003，RRID: AB_396287）、1:400 NGFR（CST，货号#8238，RRID: AB_10839265）、1:500 KLF4（R&D Systems，货号#AF3158，RRID: AB_2130245）、1:200 LGALS3（CST，货号#89572，RRID: AB_3716630）和1:100 TROP2（R&D Systems，货号#AF1122，RRID: AB_2205662）。阳性细胞百分比的定量使用CellProfiler（RRID: SCR_007358）在非重叠图像上进行，或通过盲法人工计数完成。

**来自GEMMs的批量RNA测序样本制备与数据处理**

使用Ad-CMV-Cre启动的LP和KP肿瘤肺FFPE组织的5 μm连续切片，经苏木精-伊红（H&E）和苯胺蓝染色。H&E切片用于确认组织学特征并指导苯胺蓝连续切片的边框标注。使用微解剖镜，以无菌手术刀和剃刀从连续切片中解剖出标注好的组织样本。每个分离样本的10至14块组织合并至含100%乙醇的微量离心管中。使用RecoverAll FFPE总核酸分离试剂盒（Thermo Fisher Scientific，货号#AM1975）按照制造商方案从FFPE组织中分离RNA。使用RNeasy Mini试剂盒（QIAGEN，货号#74104）按标准方案从约15 mg快冻的SNL（Ad-CMV-Cre启动）、RPM（10个Ad-CGRP-Cre启动肿瘤和5个Ad-CMV-Cre启动肿瘤）以及RPR2（4个Ad-CGRP-Cre启动肿瘤和4个Ad-CMV-Cre启动肿瘤）原发肿瘤中分离RNA。SNL、LP、KP、RPM和RPR2肿瘤的RNA分别使用Illumina TruSeq链特异性mRNA文库构建试剂盒（货号#RS-122-2101、RS-122-2102）或Illumina TruSeq链特异性总RNA文库Ribo-Zero Gold制备试剂盒（货号#RS-122-2301）按制造商方案进行文库构建。LP和KP肿瘤样本在Illumina HiSeq 2500仪器上测序，1×50 bp读长。RPR2、RPM和SNL样本在Illumina NovaSeq 6000（2×50 bp读长）或Illumina HiSeq 2500（1×50 bp读长）上测序。Fastq原始计数文件在R统计环境中进行比对。小鼠GRCm38的FASTA和GTF文件从Ensembl（RRID: SCR_002344）第94版下载，使用STAR（RRID: SCR_004463）创建参考数据库，针对50 bp读长优化剪接连接，采用两遍模式输出按坐标排序的BAM文件。比对读取使用featureCounts 1.6.3版本（RRID: SCR_012919）分配到GTF文件中注释的基因。cutadapt、FastQC（RRID: SCR_014583）、Picard CollectRnaSeqMetrics、STAR和featureCounts的输出文件通过MultiQC（RRID: SCR_014982）汇总，以检查样本异常值。为消除肿瘤RNA测序样本制备中的非期望变异来源，计数矩阵中剔除了所有非编码特征、组蛋白和核糖体RNA用于后续分析。featureCounts输出文件合并为单一原始计数矩阵。在R中进行DESeq2（RRID: SCR_015687）分析后获得Log2(counts+1)转换的标准化强度值，用于获取GEMM肿瘤的基因表达水平。

**来自BEAS-2B的批量RNA测序样本制备与数据处理**

使用RNeasy mini试剂盒（QIAGEN，货号#74104）从TRE-KLF4转导的BEAS-2B（RRID: CVCL_0168）细胞经250 ng/mL多西环素处理48小时后提取总RNA。RNA由MedGenome处理，cDNA文库使用Illumina TruSeq链特异性总RNA试剂盒制备。文库在NovaSeq 6000/X Plus上测序，读长100 bp，每个样本目标为至少30 mol/L的配对读取。每个样本读取数超过70 mol/L，读取使用STAR比对至参考人类基因组（GRCh38/hg38），使用HTSeq（RRID: SCR_005514）估算每个基因的读取数，使用DESeq2进行归一化。多西环素组与无多西环素组之间差异表达基因的Log2FC用于使用Python包GSEApy（66）进行基因集富集分析（GSEA）以及Enrichr分析。

**来自SNL肿瘤类器官的批量RNA测序样本制备与数据处理**

使用RNeasy mini试剂盒（QIAGEN，货号#74104）从消化至单细胞悬液的SNL肿瘤类器官中提取总RNA。RNA由Duke基因组核心设施处理，cDNA文库使用Watchmaker mRNA文库制备试剂盒（Watchmaker Genomics，7BK0001）制备。文库在NextSeq 1000上测序，读长100 bp，每个样本目标为至少30 mol/L的配对读取。读取使用STAR比对至含GFP的自定义小鼠基因组（GRCm38），使用Bioconductor GenomicAlignments包中的summarizeOverlaps功能（RRID: SCR_024236）估算每个基因的读取数。sgNTCi与sgKlf4i-1之间差异表达基因的Log2FC用于使用Python包GSEApy（66）进行GSEA以及Enrichr分析。

**MicroCT成像**

SNL小鼠在Cre介导的重组启动肿瘤后4周开始，使用MicroCT成像监测肿瘤发育。小鼠经异氟烷麻醉，使用小动物Quantum GX2 microCT（Perkin Elmer）进行成像。Quantum GX2图像采集参数为：2分钟扫描时间，45 mm分辨率，90 kV，88 mA电流。

**统计分析**

其余统计分析使用GraphPad Prism或Python完成。误差棒显示为均值±标准差，另有注明者除外。显著性通过以下方法确定：Student双尾非配对t检验（95%置信区间，P<0.05）、Mann-Whitney U检验、采用Tukey诚实显著差异检验校正多重比较的单因素方差分析、采用Sidak校正多重比较的双因素方差分析，或采用Bonferroni校正多重比较的Kruskal-Wallis检验后接Dunn检验。所有统计细节在相应图注中进一步描述。

**材料可用性**

本研究使用的人类肺鳞癌和肺腺癌组织因稀缺性而不可获得。肿瘤来源的类器官因源自原发肿瘤而在可用性上存在限制，但可在合理请求下提供。

**结果**

**KRT13在LUSC中高度富集**

近期研究鉴定了新的肺细胞群体（4、5、25），包括KRT13?丘陵细胞。为确定肺癌中是否存在类似状态，我们使用RNA-seq在代表肺癌主要组织学亚型的多种肺癌GEMMs中查询Krt13的表达，包括来自KP小鼠的腺癌（肺腺癌）、来自SNL或LP小鼠的鳞状肿瘤（LUSC）以及来自RPR2或RPM小鼠的小细胞肺癌（SCLC）（13、26、35、43、67、68）。我们观察到Krt13在鳞状GEMMs中特异性大量表达（图1A）。通过免疫组化，腺癌和SCLC中KRT13表达缺失，但在鳞状肿瘤中高度富集（图1B和C）。为确定这一关联在人类鳞状肿瘤中是否一致，我们检查了来自TCGA的肺腺癌和LUSC的RNA-seq数据。与肺腺癌相比，我们在LUSC中观察到KRT13表达显著增高（图1D）。人类肺癌TMA（n=41，含肿瘤组织）中，与腺癌样本相比，鳞状癌中KRT13表达显著升高，大多数鳞状癌患者活检样本（20例中16例）显示KRT13?细胞，每个肿瘤中KRT13?细胞平均约占22%（图1E和F）。值得注意的是，小鼠和人类鳞状肿瘤均表现出KRT13表达的瘤内异质性（图1B–E）。这些数据表明KRT13?细胞在小鼠和人类鳞状肿瘤的亚群中高度富集。

**图1. KRT13在LUSC中高度富集。** A. 各GEMM中按组织学类型分类的肺肿瘤RNA-seq的Log2标准化Krt13计数。LUAD，肺腺癌。单因素方差分析。B和C. 各GEMM中KRT13的IHC（B），以及H评分和KRT13?面积百分比定量（C）。比例尺，20 μm。单因素方差分析。D. TCGA中人类肺腺癌和SCC的KRT13 RSEM。双尾t检验。E和F. 人类肺癌肿瘤TMA中KRT13的IHC——2张TMA切片中的1张；红色，SCC；蓝色，肺腺癌；黑色，非小细胞肺癌/大细胞癌；灰色，肿瘤组织不足；（E）以及H评分和KRT13?面积百分比定量（F）。比例尺，1 mm（总览）；100 μm（插图）。双尾t检验。每个数据点代表一个独立肿瘤。误差棒，均值±标准差。ns，无显著性；*，P≤0.05；**，P≤0.01；***，P≤0.001；****，P≤0.0001。

**图1. KRT13在LUSC中高度富集。** A. 各GEMM中按组织学类型分类的肺肿瘤RNA-seq的Log2标准化Krt13计数。LUAD，肺腺癌。单因素方差分析。B和C. 各GEMM中KRT13的IHC（B），以及H评分和KRT13?面积百分比定量（C）。比例尺，20 μm。单因素方差分析。D. TCGA中人类肺腺癌和SCC的KRT13 RSEM。双尾t检验。E和F. 人类肺癌肿瘤TMA中KRT13的IHC——2张TMA切片中的1张；红色，SCC；蓝色，肺腺癌；黑色，非小细胞肺癌/大细胞癌；灰色，肿瘤组织不足；（E）以及H评分和KRT13?面积百分比定量（F）。比例尺，1 mm（总览）；100 μm（插图）。双尾t检验。每个数据点代表一个独立肿瘤。误差棒，均值±标准差。ns，无显著性；*，P≤0.05；**，P≤0.01；***，P≤0.001；****，P≤0.0001。关闭图1。

KRT13 在 LUSC 的非基底亚群中表达

先前的研究揭示了 LUSC 中的功能异质性，包括具有连续移植肿瘤能力的 NGFR+SCA1+ TPC 群体 (13)。大多数基因工程小鼠模型 (GEMMs) 中的鳞状肿瘤是通过从粘液样状态转分化而来的 (7, 26, 30–32)。鉴于 KRT13 在鳞状肿瘤中的异质性表达 (图 1B–E)，我们试图通过单细胞 RNA 测序 (scRNA-seq) 在单细胞水平评估鳞状 GEMMs 中的 Krt13 表达。利用 Sox2-Ires-Gfp 等位基因中的 GFP 报告基因，我们从 Ad-CMV-Cre 感染的 SNL 小鼠中流式分选了 CD45?GFP+ 肿瘤细胞。对分选的 CD45?GFP+ 肿瘤细胞进行了 scRNA-seq，获得了 3,663 个肿瘤细胞，但很少有细胞表达通过免疫组化 (IHC) 在鳞状肿瘤中观察到的经典基底相关鳞状标志物 Krt5、Trp63、Pitx1 和 Ngfr。相反，大多数 CD45?GFP+ 肿瘤细胞表达了粘液腺癌标志物。为了捕获更多基底样肿瘤细胞，我们流式分选了 Ad-CMV-Cre 感染的 SNL 肿瘤并分离出 CD45?GFP+NGFR+ 细胞（补充图 S1A），据报道该群体包括 TPC 群体。我们通过 scRNA-seq 获得了 4,363 个额外的肿瘤细胞，这些细胞富集了鳞状标志基因 (图 2A–C)。与先前的研究 (26, 51) 一致，表达基底相关标志物的肿瘤细胞中，粘液标志物 Spdef、Hnf4a 和 Gkn1 表达较低 (图 2C)。Krt13 表达在基底富集团簇中较低但存在，而在粘液腺癌富集团簇中缺失 (图 2D)。一致地，对 Ad-CMV-Cre 感染的 SNL 肿瘤连续切片进行的 IHC 显示，KRT13 富集于 KRT5+ 鳞状区域，而在 HNF4A+ 粘液区域缺失 (图 2E)。共免疫荧光 (co-IF) 显示，KRT13 在邻近但不同于表达 TRP63 的基底细胞的细胞中高度表达 (图 2F)。这种 KRT13 和 TRP63 之间大部分互斥的模式通过相关性分析在单细胞水平得到验证，显示 Krt13 与基底或粘液腺癌标志物不相关 (图 2G)。这些数据表明，KRT13+ 细胞富集于非粘液、非基底的鳞状肿瘤细胞亚群中。

图 2. 查看大图 下载幻灯片
KRT13 在 LUSC 的非基底亚群中表达。A 和 B，Ad-CMV-SNL 肿瘤细胞的 scRNA-seq UMAP，通过 Leiden 聚类 (A) 或按分选群体标记 (B)，GFP+ 或 GFP+/NGFR+。C，来自 A 的 UMAP 中的鳞状和粘液腺癌标志物。D，来自 A 的 UMAP 中的 Krt13，带有按流式分选分组的点图 (点大小，表达百分比；颜色，平均表达量)。E，Ad-CMV-SNL 肺中具有鳞状细胞癌 (SCC) 和粘液腺癌的代表性连续切片 IHC。n = 6 只小鼠。比例尺，100 μm (左)；50 μm (插图)。F，Ad-CMV-SNL 肿瘤中 KRT13 (绿色)/TRP63 (红色) 的免疫荧光。n = 4 只小鼠。比例尺，75 μm。G，来自 A 的 scRNA-seq 的基因表达相关性分析。

由 club 细胞发起的肿瘤具有早期且丰富的 KRT13 表达

鉴于 Krt13+ 丘状细胞介于基底状态和 club 状态之间 (4)，且 club 细胞可以再生基底细胞群体 (69)，我们推测由 club 细胞发起的肿瘤细胞可能具有去分化至 KRT13+ 状态的能力。使用 Ad-CCSP-Cre 病毒，我们在 SNL 小鼠中诱导 club 细胞产生肿瘤，以确定这是否会改变 Krt13+ 肿瘤细胞群体的丰富度或质量。与 Ad-CMV-Cre 发起的肿瘤一样，我们首先分选了 Ad-CCSP-Cre 驱动的 CD45?GFP+ 肿瘤细胞 (CCSP-GFP+，“S1")，发现缺乏基底相关基因表达。随后，我们对 Ad-CCSP-Cre 感染的 SNL 肺进行了第二轮测序，包含分选的 CD45?GFP+ (CCSP-GFP+，“S2") 和 CD45?GFP+NGFR+ 基底富集肿瘤细胞的混合物。为了后续的 scRNA-seq 分析，将来自这两个集合的细胞与 Ad-CMV-Cre 发起的肿瘤细胞合并。经过预处理步骤，我们获得了 4,012 个 club 细胞衍生的肿瘤细胞，它们在很大程度上与 Ad-CMV 发起的群体明显不同地聚类 (图 3A 和 B)。分选的 NGFR+ 肿瘤细胞富集了基底标志基因 (补充图 S2A)。我们确认了 Ad-CCSP 衍生的肿瘤细胞中存在粘液腺癌和鳞状群体 (图 3B 和 C)，证明 club 细胞可以作为 SNL 鳞状肿瘤的起源细胞。Krt13+ 细胞在 Ad-CCSP 发起的肿瘤细胞中比 Ad-CMV 发起的肿瘤细胞高度富集，特别是在缺乏粘液和基底标志物的团簇中 (图 3B–D)。Tmprss11b 编码一种丝氨酸蛋白酶，影响乳酸出口、肿瘤 pH 值和免疫细胞浸润 (70, 71)，与 Krt13 表达相关 (补充图 S2B 和 S2C)。与 Ad-CMV 驱动的肿瘤相比，在 Ad-CCSP 发起的肿瘤中，KRT13 存在于粘液腺癌和鳞状区域 (图 3E 和 F；补充图 S2D)。鉴于粘液腺癌似乎先于鳞状分化出现 (26, 32, 33)，这些数据表明与 Ad-CMV 发起的肿瘤相比，KRT13 在 club 细胞发起的肿瘤中富集且可能出现得更早。

图 3. 查看大图 下载幻灯片
由 club 细胞发起的肿瘤具有早期且丰富的 KRT13 表达。A 和 B，Ad-CMV-SNL 和 Ad-CCSP-SNL 肿瘤细胞的 scRNA-seq UMAP，通过 Leiden 聚类 (A) 或分选群体 (B)。C，来自 A 的 UMAP 中的鳞状和粘液腺癌标志物。D，来自 A 的 UMAP 中的 Krt13，带有小提琴图。Kruskal-Wallis 检验配合 Dunn 检验及 Bonferroni 校正。E 和 F，Ad-CMV-SNL 和 Ad-CCSP-SNL 肿瘤中 KRT5、HNF4A 和 KRT13 的 IHC (E) 及 H 评分定量 (F)。勾勒出鳞状 (红色) 和腺癌 (蓝色) 病变。比例尺，5 mm (左)；2 mm (插图)。每个数据点代表一个个体肿瘤。n = 5 Ad-CMV-SNL; n = 6 Ad-CCSP-SNL。双因素方差分析配合 Sidak 校正。G–I，来自 A 的 UMAP 中的基因评分 (G)，细胞类型分类 (H)，以及按细胞类型的评分小提琴图 (I)。Kruskal-Wallis 检验配合 Dunn 检验及 Bonferroni 校正。误差线，均值 ± 标准差。ns，无显著性；*, P ≤ 0.05; **, P ≤ 0.01; ****, P ≤ 0.0001; n.s., 无显著性。

KRT13 标记鳞状肿瘤中的丘状细胞样状态

为了确定 Krt13+ LUSC 细胞是否表现出丘状细胞样表型，我们通过鉴定在两个独立数据集 (补充表 S1；参考文献 4, 5) 中保守的正常丘状细胞特异性基因，生成了一个“丘状细胞签名”。具有高丘状签名的肿瘤细胞存在于 Ad-CMV 和 Ad-CCSP 发起的肿瘤中，与 Krt13 表达细胞强烈重叠 (图 3D–G)，并与具有最高粘液和基底签名的细胞明显不同 (图 3G 和 H；补充图 S3A 和 S3C；补充表 S2 和 S3)。事实上，Krt13 和丘状基因与基底、粘液或其他细胞状态标志物不相关 (补充图 S3C)。这些结果表明，Krt13 在 LUSC 中标记了一种转录上不同的丘状细胞样状态，正如正常气道上皮中一样。接下来，我们应用了额外的正常细胞类型签名，并将细胞状态分配给小鼠肿瘤 scRNA-seq 数据集中的 Leiden 团簇。与杯状细胞表型和粘液腺癌之间已知的关系一致，这两个签名大部分重叠，并通过相关性分析聚类在一起 (图 3G 和 H；补充图 S3D 和 S3E)。club 细胞签名与丘状签名重叠最多，并与基底签名部分重叠 (补充图 S3D 和 S4E)，这与正常 club、丘状和基底细胞之间的谱系关系一致 (4)。鉴定到一小群具有簇状细胞基因表达程序的肿瘤细胞，它们与其他细胞群体单独聚类 (图 3G–I；补充图 S3A–S3C，以及 S3F 和 S3G；参考文献 4)。最近的报告注意到鳞状肿瘤内或附近有簇状细胞样肿瘤细胞 (72, 73)。一致地，我们实验室最近发现基底细胞可以产生簇状细胞样小细胞肺癌 (SCLC) 和鳞状肿瘤，且患者中的联合 SCLC 可以同时包含簇状细胞样 SCLC 和鳞状区域 (45, 73)，表明肺癌中簇状和基底状态之间存在转录关系。与 Ad-CCSP 驱动的肿瘤相比，这些簇状细胞样癌细胞在 Ad-CMV 驱动的肿瘤中富集 (补充图 S3H)，表明起源细胞可能存在潜在影响。接下来，我们使用最近一项研究 (25) 的基因集来区分基底丘状细胞和腔侧丘状细胞与其他癌症状态 (补充表 S4 和 S5)。将这些签名应用于小鼠肿瘤 scRNA-seq 数据集显示，Krt13+ 丘状细胞样肿瘤细胞与腔侧丘状评分重叠最多，而基底丘状评分在基底样细胞中最高 (图 3G 和 H；补充图 S3F)。Ad-CCSP 驱动的肿瘤包含大多数腔侧丘状细胞样细胞，而 Ad-CMV 驱动的肿瘤包含大多数基底丘状细胞样细胞 (补充图 S3H)。值得注意的是，与粘液和基底样群体相比，腔侧丘状细胞样肿瘤细胞表现出中间的 club、杯状和粘液签名 (图 3G–I；补充图 S3D 和 S3E)。这些数据表明起源细胞影响不同丘状细胞样状态的存在，且 SNL 鳞状肿瘤中的肿瘤谱系可塑性可能反映正常发育程序，即 club、丘状和基底细胞状态之间的转录关系 (补充图 S3I；参考文献 4, 25)。

腔侧丘状细胞样细胞增殖减少并表达免疫调节基因签名

为了揭示与每种细胞状态相关的转录模式，通过比较每种细胞状态与所有其他细胞，在指定的腔侧丘状、基底丘状或基底样团簇中鉴定出顶级差异表达基因 (DEGs)，随后进行 Enrichr 通路分析 (补充表 S6)。腔侧丘状细胞样细胞富集了免疫通路、中性粒细胞脱粒和细胞因子信号传导的签名 (图 4A)，包括 B2m、Lgals3 和 Il1a (补充表 S7)。腔侧丘状细胞样细胞富集了干扰素 (IFN) 调节基因表达 (Irf1、Irf7 和 Irf9) 和免疫检查点基因，包括 Cd274 (编码 PD-L1)、Ceacam1 和 Vtcn1 (补充图 S4A)。基底和基底丘状细胞样团簇均富集了增殖相关基因签名 (图 4B)，表明与基底和基底丘状细胞样肿瘤细胞相比，腔侧丘状细胞样细胞增殖可能较少。一致地，Ki67 表达局限于 TRP63+KRT13? 细胞，且在鳞状肿瘤内的 KRT13+ 区域几乎缺失 (图 4C)。细胞周期特异性基因签名显示，与基底和基底丘状状态相比，腔侧丘状细胞状态中处于 S 期和 G2–M 期的细胞比例较低，与增殖减少一致 (补充图 S4B)。与剩余细胞相比，基底样和基底丘状细胞样状态具有相似的基因表达 (图 4B；补充表 S6)。

图 4. 查看大图 下载幻灯片
KRT13 标记鳞状肿瘤中的丘状细胞样状态。A 和 B，图 3A 中 SNL 肿瘤细胞按细胞类型进行的基因集富集分析 (GSEA) (Reactome Pathways 2024, Enrichr)。C，SNL 鳞状肿瘤中 KRT13 (绿色)/TRP63 (红色)/Ki67 (蓝色) 的代表性免疫荧光，以及按标志物共表达进行的 Ki67+ 定量。n = 4 只小鼠。比例尺，50 μm。单因素方差分析。D 和 E，人类 LUSC 细胞 (18 名患者，66) 的 scRNA-seq UMAP，通过 Leiden 聚类 (D) 或患者 ID (E) 进行。F–H，来自 D 的 UMAP 中的腺癌 (NAPSA、NKX2-1 和 SFTPB)、鳞状 (TP63、KRT5 和 PITX1) 和丘状 (KRT13) 标志物。I 和 J，来自 D 的 UMAP 中的丘状和基底评分 (I)，以及细胞类型分类和按细胞类型的 KRT13 (J)。Mann-Whitney U 检验。K，如 J 中所示的按患者 ID 划分的丘状细胞样细胞百分比。

L，通过细胞类型对D和J中的人类肿瘤细胞进行GSEA分析（Reactome Pathways 2024，Enrichr）。M，按丘状比例排序的LUSC肿瘤CIBERSORTx去卷积分析（上图）；按相同顺序排列的白细胞去卷积分析（下图）。N，来自D的UMAP中的细胞周期分配，以堆叠条形图展示各细胞状态下的周期分布。Mann-Whitney U检验。**，P ≤ 0.01；****，P ≤ 0.0001。Treg，调节性T细胞。

图4. 查看大图下载幻灯片KRT13标记鳞状肿瘤中的丘状状态。A和B，按细胞类型对图3A中的SNL肿瘤细胞进行GSEA分析（Reactome Pathways 2024，Enrichr）。C，SNL鳞状肿瘤中KRT13（绿色）/TRP63（红色）/Ki67（蓝色）的代表性免疫荧光染色，按标志物共表达进行Ki67?定量分析。n = 4只小鼠。比例尺，50 μm。单因素方差分析。D和E，来自人类LUSC细胞（18名患者，66个样本）的单细胞RNA测序UMAP图，按Leiden聚类（D）或患者ID（E）展示。F–H，来自D的UMAP图中的腺癌（NAPSA、NKX2-1和SFTPB）、鳞状（TP63、KRT5和PITX1）和丘状（KRT13）标志物。I和J，来自D的UMAP中的丘状和基底评分（I），以及按细胞类型划分的细胞类型分类和KRT13表达（J）。Mann-Whitney U检验。K，按患者ID展示的丘状细胞百分比，如J所示。L，通过细胞类型对D和J中的人类肿瘤细胞进行GSEA分析（Reactome Pathways 2024，Enrichr）。M，按丘状比例排序的LUSC肿瘤CIBERSORTx去卷积分析（上图）；按相同顺序排列的白细胞去卷积分析（下图）。N，来自D的UMAP中的细胞周期分配，以堆叠条形图展示各细胞状态下的周期分布。Mann-Whitney U检验。**，P ≤ 0.01；****，P ≤ 0.0001。Treg，调节性T细胞。

关闭图4。通过比较基底样和基底丘状样群体，我们观察到基底丘状样细胞具有升高的免疫调节特征表达和紧密连接基因表达增加，而基底样细胞富集于翻译相关特征（图4B；补充图S4C和S4D；补充表S6）。总之，这些数据表明，KRT13?管腔丘状样状态的增殖性低于基底样群体，且基底丘状样群体兼具基底和管腔丘状样状态的特征。为确定KRT13?丘状样状态是否存在于人类鳞状肿瘤中，我们分析了来自18例患者肿瘤的单细胞数据（n = 43,126个细胞；图4D和E；参考文献47），排除了正常肺细胞类型。与预期一致，鳞状标志物（KRT5、PITX1和TP63）明显高于罕见可检测的腺癌标志物（NAPSA、NKX2-1和SFTPB；图4F和G）。与SNL肿瘤一致，人类肿瘤细胞中KRT13的高表达与丘状评分的富集相关（图4H和I）。尽管管腔丘状评分和基底丘状评分在很大程度上重叠，但管腔丘状评分更密切地反映了KRT13表达分布（图4H和I；补充图S4E）。Leiden聚类主要通过患者分离细胞，这可能是由于患者间潜在的遗传和非遗传异质性，正如其他研究所观察到的那样（3，47，58），这限制了通过Leiden聚类将细胞识别为不同细胞类型的能力。为克服这些局限性，我们使用定义高丘状评分和低基底评分表达的截止标准将单个细胞分配给丘状样状态，结果显示18例人类患者样本中有17例存在丘状样细胞，每个肿瘤中约占1%至20%的细胞（图4J和K；补充表S8）。类似地，18例人类患者样本中有16例检测到KRT13表达细胞，每个肿瘤中约占2%至50%的细胞（补充图S4F；补充表S8）。无论采用何种分类方法，丘状样细胞在转录水平上的检测频率与在人类组织中蛋白质水平上检测到的频率相似（20例患者样本中的16例；图1E）。为确保丘状样细胞在患者间共享相似性并代表跨患者肿瘤的独特转录亚群，我们对每位患者的基底样和丘状样细胞进行了相关性分析。在大多数情况下，丘状样肿瘤细胞与其他患者的丘状样细胞在转录上更为相似，而非与同一肿瘤中的基底样细胞相似——支持一种独特且保守的转录状态（补充图S4G）。人类丘状样肿瘤细胞富集于免疫、中性粒细胞脱颗粒和鳞状分化特征，包括角化和角质化（图4L；补充表S9）——与小鼠模型中的模式相似（图4A）。通过对LUSC肿瘤的bulk RNA-seq数据进行去卷积分析，我们识别出许多含有高比例丘状样细胞的肿瘤（图4M）。去卷积分析用于确定肿瘤内免疫群体的相对比例。与转录预测和最近发表的工作一致（71），丘状比例较高的肿瘤富集于髓系群体，包括中性粒细胞和单核细胞，而丘状比例较低的肿瘤则预测具有肿瘤抑制性群体，包括活化T细胞和M1巨噬细胞（图4M；补充表S10）。丘状样细胞比例较高的肿瘤还具有M1/M2巨噬细胞比值降低、活化CD4? T细胞/调节性T细胞比值降低以及活化/静息NK细胞比值降低，提示更为免疫抑制性的微环境（补充图S4H）。这些数据与SNL肿瘤最近的空间转录组学结果一致，我们的同事发现Tmprss11b高表达的丘状样区域中M2巨噬细胞和单核细胞群体增加，而在Tmprss11b敲除后CD4? T细胞浸润增加（71）。细胞周期分析显示，与LUSC中的其他细胞状态相比，人类丘状样肿瘤细胞的增殖性相对较低（图4N），这与小鼠中的发现一致（图4C；补充图S4B）。总之，这些数据表明，一种低增殖性的KRT13?丘状样状态在小鼠和人类LUSC中均得到保守。

丘状样状态起源于NGFR?基底样肿瘤细胞

为确定KRT13?状态能否起源于基底样TPC群体，我们采集了Ad-CMV-Cre感染的SNL小鼠肿瘤，通过流式分选获得CD45?GFP?NGFR?肿瘤细胞，并建立了类器官（图5A）。Ad-CMV衍生的SNL肿瘤类器官重现了体内SNL鳞状肿瘤中的关键结构，与其他研究类似（27，28，74，75）。我们观察到角化结构，以及增殖性Ki67?外缘，与基底TPC标志物NGFR相吻合（图5B和C）。KRT13?细胞群体位于类器官内部，与ΔNp63?（也称P40?）基底层重叠有限（图5D）。并非所有类器官都有KRT13?细胞群体，但所有类器官都含有基底样细胞，这与KRT13?细胞从基底细胞中产生的结论一致。为确认TPC样细胞再生KRT13?群体的能力，将活肿瘤类器官解离并按表面NGFR表达分为两组（NGFR高和NGFR低；图5E；补充图S5A）。与NGFR低细胞相比，NGFR高细胞产生了更多且更大的类器官（图5F）。NGFR低细胞能够形成类器官，表明较非基底样的状态可能具有再生NGFR?基底样状态的可塑性。两个分选群体均能够再生出含有互斥性TP63?和KRT13?细胞的类器官（图5G）。这些数据表明基底样和丘状样状态之间存在可塑性，NGFR高细胞能产生KRT13?细胞，而NGFR低细胞保持一定能力重新获得基底样状态。

图5. 查看大图下载幻灯片丘状样状态可起源于NGFR?基底样肿瘤细胞。A，来自GFP? NGFR? SNL肿瘤细胞的类器官明场和免疫荧光图像。比例尺，100 μm。B，SNL肿瘤类器官（n = 2个培养物）和鳞状肿瘤（n = 6只小鼠）的H&E染色。箭头指示角化结构。比例尺，100 μm。C和D，SNL肿瘤类器官（n = 3）的免疫荧光染色：Ki67（红色）/NGFR（青色）；比例尺，100 μm（C），P40（紫色）/KRT13（绿色）；比例尺，50 μm（D）。E，类器官分选和单细胞RNA测序方案；蓝色群体用于单细胞RNA测序。F，NGFR分选后在Matrigel中重板10天的类器官数量和面积。每个数据点代表一个4×显微视野。双尾t检验。G，分选后10天类器官中TP63（紫色）/KRT13（绿色）的免疫荧光染色。n = 2个实验，每个实验6个20×视野。H和I，如E所述对类器官单细胞RNA测序进行Leiden聚类（H），显示NGFR高、NGFR低和NGFR高增殖（4周）群体（I）。J和K，来自H的UMAP中的丘状（Krt13）和基底（Ngfr、Krt5、Trp63和Pitx1）标志物表达（J）和评分（K）。L，来自H的细胞类型分类。所有图像均为代表性图像。误差棒，均值 ± 标准差。**，P ≤ 0.01。

图5. 查看大图下载幻灯片丘状样状态可起源于NGFR?基底样肿瘤细胞。A，来自GFP? NGFR? SNL肿瘤细胞的类器官明场和免疫荧光图像。比例尺，100 μm。B，SNL肿瘤类器官（n = 2个培养物）和鳞状肿瘤（n = 6只小鼠）的H&E染色。箭头指示角化结构。比例尺，100 μm。C和D，SNL肿瘤类器官（n = 3）的免疫荧光染色：Ki67（红色）/NGFR（青色）；比例尺，100 μm（C），P40（紫色）/KRT13（绿色）；比例尺，50 μm（D）。E，类器官分选和单细胞RNA测序方案；蓝色群体用于单细胞RNA测序。F，NGFR分选后在Matrigel中重板10天的类器官数量和面积。每个数据点代表一个4×显微视野。双尾t检验。G，分选后10天类器官中TP63（紫色）/KRT13（绿色）的免疫荧光染色。n = 2个实验，每个实验6个20×视野。H和I，如E所述对类器官单细胞RNA测序进行Leiden聚类（H），显示NGFR高、NGFR低和NGFR高增殖（4周）群体（I）。J和K，来自H的UMAP中的丘状（Krt13）和基底（Ngfr、Krt5、Trp63和Pitx1）标志物表达（J）和评分（K）。L，来自H的细胞类型分类。所有图像均为代表性图像。误差棒，均值 ± 标准差。**，P ≤ 0.01。

关闭图5。为确定肿瘤类器官的转录异质性以及基底样细胞再生丘状样细胞的能力，我们对新解离的NGFR高和NGFR低细胞，以及分选后允许在培养中再生的NGFR高细胞（"NGFR高增殖"）进行了单细胞RNA测序（图5E；补充图S5A）。类器官在很大程度上重现了在鳞状SNL肿瘤中观察到的转录异质性，具有Ngfr/Trp63高表达的基底样细胞和Krt13/Tmprss11b高表达的丘状样细胞的明显群体（图5H–J；补充图S5B）。尽管基底评分在整个转录空间中都高度表达，但仍存在一个丘状评分富集的亚群（图5K）。类器官条件下基底样状态的富集并不令人惊讶，因为研究表明Matrigel培养条件支持基底样状态（45）。基底丘状和管腔丘状特征分别与总体基底和丘状特征重叠（图5K；补充图S5C），与SNL肿瘤中的模式类似（图3G）。鉴于黏液性组织病理学在体内先于鳞状分化出现（13，20，26，35，36，76），我们并不期望在类器官中观察到黏液样细胞，且确实观察到黏液标志物极为罕见且表达量低（补充图S5C）。NGFR高细胞的增殖重新占据了新分选的NGFR高和NGFR低细胞所占的整个转录空间，包括Krt13和丘状样群体的重新出现，这表明基底细胞能够再生所有捕获的细胞状态（图5L；补充图S5D）。在分选时，Krt13表达和丘状评分仅限于NGFR低（而非NGFR高）细胞（补充图S5D）。与Ki67免疫染色一致（图5C），基于细胞周期基因表达，丘状样类器官细胞增殖性较低（补充图S5E）。类器官丘状样细胞还上调中性粒细胞脱颗粒和角质化基因集（补充图S5F；补充表S11），与小鼠和人类肿瘤数据一致——总体上支持基底样细胞产生分化程度更高的丘状样状态。

KLF4富集于鳞状肿瘤超基底丘状样状态

我们评估了Enrichr中的ENCODE和ChEA转录因子基因集，以识别驱动丘状样肿瘤状态的主要转录调节因子（补充图S6A–C；补充表S12）。小鼠和人类数据集中的基底样和基底丘状样细胞预测了增殖和基底层系转录因子MYC、MAX、P63和SOX2（补充图S6A），与其相比管腔丘状样细胞具有较高增殖性一致。KLF4是小鼠和人类丘状样肿瘤细胞的主要预测调节因子，同时也是来自两个独立数据集的正常气道丘状细胞的主要预测调节因子（补充图S6B和S6C；参考文献4，5）。KLF4是调节丘状样状态的有前景的候选因子，因为在其他鳞状上皮组织中也有其作用。KLF4可以直接调节食管癌中KRT13的表达（77），并且可以抑制基底TPC因子SOX2、TP63和PITX1（16）。

为了确定KLF4在LUSC中的表达模式，我们查询了来自肺癌基因工程小鼠模型（GEMMs）和TCGA的RNA-seq数据，结果显示与腺癌相比，小鼠和人类LUSC中Klf4/KLF4的表达显著富集（图6A和B）。

图6. 放大视图 下载幻灯片

**KLF4富集于上基底层穹隆状状态并调控KRT13**

A，来自指示的GEMMs肺癌肿瘤的RNA-seq中Log2标准化的Klf4表达量。单因素方差分析。B，来自人类肺腺癌（LUAD）和鳞癌（TCGA）的KLF4 RSEM表达量。双尾t检验。C–E，Ad-CMV-SNL鳞状肿瘤中的免疫荧光染色：KLF4（红色），dNP63/P40（紫色），n = 2（C）；NGFR（绿色）/KLF4（红色），n = 2（D）；KRT13（绿色）/KLF4（红色），n = 3（E）。比例尺，100 μm（C和D），50 μm（E）。F，鳞状肿瘤组织示意图，包含基底样细胞、KLF4?上基底层细胞和KRT13?穹隆状细胞。G，SNL类器官中KRT13（绿色）/KLF4（红色）、dNP63/P40（青色）的免疫荧光染色，n = 3。H，经CRISPR抑制（CRISPRi）敲低Klf4后SNL类器官中KRT13（绿色）和KLF4（红色）的免疫荧光染色，n = 2个实验，≥4个视野。I和J，经CRISPRi敲低Klf4与sgNTCi对照的SNL类器官的免疫印迹（10天；I）以及类器官数量和大小（7天；J）。单因素方差分析。K–M，经CRISPRi敲低Klf4后SNL类器官中Ki67（青色）和KLF4（红色）的免疫荧光染色，并进行KLF4?（L）和Ki67?（M）核定量，n = 2。N和O，SNL类器官中表达TRE-GFP或TRE-KLF4并用doxy（每48小时1 μg/mL）处理的单因素方差分析免疫印迹—10天（N）及类器官数量—7天（O）。双尾t检验。每个数据点代表一个4×（类器官生长）/20×（免疫荧光定量）显微镜视野。误差线代表均值±标准差；*，P ≤ 0.05；**，P ≤ 0.01；***，P ≤ 0.001；****，P ≤ 0.0001。F，使用BioRender制作。Reyes, T. (2026) https://BioRender.com/wf80sto.

为了确定LUSC中KLF4的表达和定位，我们评估了小鼠SNL肿瘤中基底标记物ΔNp63/P40和KLF4的表达。KLF4呈现出核内及类似上基底层的表达模式，其中KLF4与P40?细胞紧密相邻，但大部分不重叠（图6C）。在Ad-CMV诱导和Ad-CCSP诱导的肿瘤中，KLF4相对于基底TPC标记物NGFR同样位于上基底位置（图6D；补充图S6D）。KLF4在一层KRT13?细胞（通常为最外层的KRT13?基底近侧细胞）中高度表达，而在最内层的KRT13?基底远侧细胞中缺失（图6E和F；补充图S6D）。KRT13?/KLF4?肿瘤群体的存在暗示了一种不依赖KLF4维持的KRT13?状态。在SNL类器官中，KLF4的表达富集于NGFR?/P40?基底样细胞的上基底位置，且重叠极少（图6G；补充图S6E）；KLF4在大多数KRT13?细胞中表达，支持类器官具有与鳞状肿瘤相似的组织结构。这些数据表明鳞状肺肿瘤中存在多个层次的瘤内异质性（图6F），类似于正常分层上皮（如皮肤和阴道上皮）（41, 78）。这些数据提示KLF4被定位于促进KRT13?穹隆状肺肿瘤细胞的产生或分化。

**KLF4促进KRT13?穹隆状状态**

为确定KLF4在穹隆状肿瘤状态中的功能作用，我们尝试耗竭KLF4并确定其对KRT13和穹隆状状态的影响。由于SNL肿瘤类器官死亡，传统的CRISPR基因编辑方法未能成功敲除Klf4，因此我们采用了CRISPR抑制技术，将转录抑制因子KRAB与dCas9融合（64）。与sgNTCi相比，靶向Klf4的构建体（sgKlf4i）有效降低了SNL类器官中KLF4的表达，尤其是向导#1（图6H和I）。通过共免疫荧光和免疫印迹，Klf4敲低后类器官表现出减弱且更弥散的KRT13染色（图6H和I）。在sgKlf4i类器官内观察到KLF4表达的差异性，其中KLF4功能正常的sgKlf4i类器官中保留了KRT13表达，而KLF4缺失的sgKlf4i类器官中KRT13完全缺失（补充图S6F）。KLF4抑制不改变KRT5表达，但增加了PITX1表达（图6I），PITX1是一种转录因子，与SOX2和TP63在基底皮肤TPC中协同作用，并与KLF4存在相互拮抗关系（16）。解离和接种后生长7天，KLF4敲低略微增加了类器官频率，对类器官大小无影响（图6J）。sgKlf4i类器官显示出升高的Ki67染色，当KLF4被抑制时Ki67?细胞遍布整个类器官，而KLF4功能正常的类器官则倾向于在基底相关的外层细胞层中增殖（图6K–M）——这可能与KLF4对细胞周期退出的调控一致（16, 38, 79）。尽管增殖标记物增加，类器官大小并未增加，这可能反映了培养条件中的大小限制。这些数据表明，在类器官环境中，KLF4对于转变为增殖较慢的KRT13?穹隆状状态是必需的。

为了确定KLF4是否足以促进KRT13?穹隆状状态，我们使用doxy诱导的TRE系统（Tet-ON-TRE-GFP对比TRE-KLF4）在SNL类器官中过表达人类KLF4或GFP对照。SNL肿瘤类器官中KLF4过表达增加了KRT13水平，并显著减少了类器官生长（图6N和O）。解离并用doxy重新接种后，KLF4过表达的类器官比GFP对照更小，形成频率更低（图6O；补充图S6G）——提示KLF4对于SNL类器官中KRT13?状态的出现既必要又充分。

我们将这些发现扩展到人类LUSC来源的细胞系，这些细胞系在基线时表达不同程度的KLF4和KRT13（补充图S7A）。与小鼠类器官中的情况类似，KLF4敲低导致KRT13下降（图7A；补充图S7B），而KLF4过表达诱导KRT13（图7B）并抑制H226细胞的生长（图7C）。与KLF4缺失增加类器官增殖不同（图6I–M），H520细胞中KLF4敲除降低了增殖（补充图S7C），这可能是由于这些不同的细胞群体存在独特的限制，它们在物种、基因改变、初始细胞状态和体外培养条件上有所不同。这些数据还将KRT13表达的调控与增殖效应解偶联。

图7. 放大视图 下载幻灯片

**KLF4促进KRT13?穹隆状状态和顺铂耐药性**

A和B，H520 LUSC细胞中使用CRISPR靶向sgNTC或sgKLF4（A）以及H226 LUSC细胞中TRE-GFP或TRE-KLF4 ± doxy处理48小时（B）的免疫印迹。C，H226细胞中5天后相对于无doxy的CellTiter-Glo归一化值。双因素方差分析。D和E，BCi-NS1.1细胞中使用CRISPR靶向sgNTC或sgKLF4（D）以及BEAS-2B细胞中TRE-GFP或TRE-KLF4 ± doxy处理48小时（E）的免疫印迹。F，不同doxy剂量下BEAS-2B细胞的汇合度生长曲线。单因素方差分析。G和H，TRE-KLF4 BEAS-2B细胞 ± doxy（G）以及图6H和I中SNL类器官CRISPRi sgKlf4i-1与sgNTCi（H）的RNA-seq差异表达基因。I，SNL肿瘤类器官中KLF4 CUT&RUN读数的Krt13基因座Integrative Genomics Viewer视图。J–L，来自图3A、4D和5H的UMAP中KLF4-up得分，附带SNL肿瘤（J）、人类鳞状肿瘤（K）和类器官（L）细胞的提琴图。Kruskal-Wallis检验配合Dunn检验并进行Bonferroni校正（J）；Mann-Whitney U检验（K和L）。M–O，类器官生长（GFP?汇合度）经顺铂（M）、H?O?（N）或顺铂+ NAC（O）处理。虚线，溶剂对照。双因素方差分析，与sgNTCi按剂量比较（M和N）或与溶剂比较（O）。汇合度通过Incucyte（Sartorius）测定，按接种密度（F）或5天后与溶剂对照归一化（M–O）。误差线，均值±标准差。***，P ≤ 0.001；****，P ≤ 0.0001。

我们接下来研究KLF4是否能在正常肺基底细胞中调控KRT13，这些细胞被认为是LUSC的起源细胞（21），使用了BCi-NS1.1细胞，该细胞天然表达KLF4，并在体外培养中发生脱离基底状态的分化（图7D；补充图S7D；参考文献44, 80, 81）。使用CRISPR-Cas9编辑敲除KLF4显著降低了内源性KRT13水平，尤其是向导#3，该向导显示了最完全的DNA编辑（图7D；补充图S7D）。与H520细胞中的发现类似，BCi-NS1.1细胞中KLF4敲除导致增殖降低（补充图S7E）。

为确定KLF4是否足以在人细胞中促进KRT13?状态，将TRE-KLF4过表达构建体导入BEAS-2B细胞，该细胞被认为是一种支气管上皮细胞类型，在正常培养条件下缺乏KLF4和KRT13表达（图7E；补充图S7F）。KLF4诱导导致KRT13显著增加（图7E）。TRE-KLF4细胞短暂暴露于doxy可诱导KRT13表达，该表达在移除doxy后持续48小时，而KLF4表达恢复至基线水平（补充图S7F）。这些数据与SNL肿瘤中存在KRT13?/KLF4?细胞的观察一致，综合表明KLF4可能促进KRT13?状态的出现，但不需要维持该状态。

KLF4过表达增加了细胞周期抑制因子P21（54,113–115），并显著降低了BEAS-2B细胞的生长（图7E和F），这与在LUSC肿瘤和类器官中观察到的增殖较慢的KRT13?穹隆状状态一致（图4C、5C、6K–O和7C）。KLF4诱导后BEAS-2B细胞的转录组分析显示穹隆状态基因的显著上调，包括KRT13，以及与小鼠Krt4/Krt13?气管细胞、角质化和角蛋白化相关的基因（图7G；补充图S7G和S7H；补充表S13）。

同样，sgKlf4i-1 SNL肿瘤类器官的转录组分析显示，Krt13和hillock相关基因受到抑制（图7H；补充图S7I和S7J；补充表S13）。KLF4的过表达和敲低似乎并未改变免疫相关基因集，表明KLF4可能调控hillock样程序的一部分，但并非所有hillock相关基因（补充图S7G–S7J）。为了确定KLF4对Krt13及其他hillock相关基因的诱导是否通过直接转录调控实现，我们在SNL肿瘤类器官中进行了KLF4 CUT&RUN实验。注释的峰与预期的KLF4结合基序富集一致（补充图S7K）。在Krt13位点直接上游检测到一个KLF4结合区域（图7I），与先前注释的GKLF/KLF4响应元件一致（77）。对KLF4结合的蛋白编码基因前500个启动子区域进行Enrichr分析，显示Rho GTPase信号通路（已知调控鳞状上皮分化）、中性粒细胞脱颗粒和Ephrin信号通路富集，这些特征在跨模型的单细胞分析中均可检测到。结合的启动子还富集了与正常Krt13+小鼠气管hillock细胞相关的基因（补充图S7L和S7M；补充表S14）。最后，我们生成了KLF4诱导后在BEAS-2B细胞中上调的基因与SNL肿瘤类器官中Klf4敲低下调的基因之间的重叠基因所组成的保守51基因评分（"KLF4-up评分"），并将其应用于小鼠和人类的单细胞数据集（补充图S7N；补充表S13）。KLF4诱导的基因在所有三个单细胞数据集中均高度富集于hillock样群体中（图7J–L），支持KLF4在hillock样癌细胞中的作用。使用CIBERSORTx反卷积分析，患者肿瘤中hillock样比例与"KLF4-up评分"比例之间存在强相关性（补充图S7O）。这些数据表明，KLF4在正常肺细胞系和肿瘤环境中均促进KRT13的表达和hillock样状态的维持。KLF4在体外促进化疗耐药性

正常气道hillock细胞对多种形式的损伤具有高度抗性，包括病毒感染和物理应激（25），这促使我们探究鳞状肿瘤中的hillock样细胞是否具有类似表型。我们通过将类器官细胞以单细胞悬浮液形式处理，比较有无KLF4敲低时细胞对临床相关治疗（如顺铂和紫杉醇化疗）的反应，来评估hillock样状态是否影响这些治疗的应答。顺铂在5天内降低了类器官的增殖，与对照组相比，sgKlf4i类器官在所有测试剂量下均表现出更高的敏感性（图7M）。我们还评估了顺铂撤除后类器官的出芽生长能力。虽然对照组类器官在5和10 μM顺铂处理后的延长培养中能够重新增殖，但sgKlf4i类器官则不能（补充图S8A）。在较低剂量下，sgKLF4i-1类器官能够重新增殖，但表现出KLF4和KRT13表达的恢复，表明逃逸KLF4敲低可能有助于顺铂耐药性（补充图S8A和S8B）。有趣的是，KLF4敲低对类器官对紫杉醇的反应无影响（补充图S8C）。多项研究已确定了与化疗耐药性相关的转录程序，包括休眠的胚胎滞育样状态（56, 82）和HPCS（57），这些在跨小鼠和人类数据集中均在hillock样细胞中比basal样细胞中更为富集（补充图S8D和S8E）——表明hillock样状态类似于其他肿瘤类型中化疗耐药的持久性群体。KLF4敲除增加了人类BCi-NS1.1细胞对顺铂的敏感性，对紫杉醇反应无影响（补充图S8F–S8H）。KLF4敲除最完全的BCi-NS1.1细胞（sgKLF4-3，图7D）表现出最显著的顺铂敏感性，通过cleaved PARP和caspase-3水平测量细胞凋亡（补充图S8G）。hillock样状态的一个顶级预测调控因子是NFE2L2（NRF2；补充图S6B和S6C），它是氧化应激的主调控因子。顺铂诱导氧化应激以及DNA损伤，而这不是紫杉醇的良好注释反应，因此我们假设对顺铂的选择性增敏可能由氧化应激介导。确实，与对照组相比，KLF4耗竭的类器官对过氧化氢诱导的氧化应激表现出显著增敏（图7N）。使用抗氧化剂NAC处理可部分挽救类器官对顺铂的增殖反应（在对照组和敲低组中均如此；图7O）。近期研究表明NRF2和KLF4协同调控氧化应激反应基因（83），且NRF2与多种疗法的耐药性有关（27, 84），因此未来研究应探讨NRF2是否与KLF4在hillock样状态中协同作用。这些数据表明KLF4在体外支持化疗耐药性，与其驱动hillock样状态的能力相关，需要体内验证。一种保守的hillock样状态存在于多种鳞状肿瘤中

不同组织的SCC显示相似的病理学特征和潜在的遗传改变，特别是在LUSC、HNSCC和ESCC背景下（85）。鉴定hillock样状态最可靠的方法之一是将保守的基因特征应用于多个样本的单细胞全转录组数据。我们检索了两个已发表的SCC数据集：一个包含来自15名HNSCC患者的12,932个细胞（48），另一个包含来自60名ESCC患者的44,547个细胞（图8A；补充图S9A；参考文献49）。两种肿瘤类型均包含表达KRT13的细胞群体，以及表达basal标记物KRT5和TP63的细胞，且两者之间重叠极少（补充图S9B）。basal评分在整个数据集中广泛表达，而hillock评分则更局限于basal评分表达较低的聚类（补充图S9C），与LUSC中的模式类似（图4I）。使用用于人类LUSC分析的方法，我们通过hillock评分截断法对HNSCC和ESCC细胞分配了细胞状态（图8B）。两个数据集中的hillock样细胞均表现出细胞周期分期评估显示增殖降低；Enrichr分析显示与LUSC惊人的相似性，包括富集的固有免疫和鳞状相关基因特征（补充图S9D和S9E）。KLF4-up评分在HNSCC和ESCC的hillock样细胞中均富集（图8C）——总体而言，表明KLF4驱动的hillock样状态存在于多种鳞状肿瘤类型中。

图8. 放大图 下载幻灯片 鳞状肿瘤中一种保守的hillock样状态富集于治疗靶点。A，HNSCC（15例患者，67）和ESCC（60例患者，68）的scRNA-seq通过Leiden聚类的UMAP。B，根据A中的hillock评分进行细胞类型分类。C，A中UMAP上的KLF4-up评分，附带按细胞状态划分的提琴图。Mann–Whitney U检验。D–F，SNL肿瘤（D）、类器官（E）和人类鳞状肿瘤（F）细胞中的基因表达，取自图3A、4D和5H的UMAP，附带按细胞状态划分的提琴图。Kruskal–Wallis检验配合Dunn检验和Bonferroni校正，所有P = 2 × 10?16（D）；Mann–Whitney U检验（E和F）。G和H，SNL鳞状肿瘤中的免疫荧光（n = 2只小鼠）：TROP2（绿色）/KRT13（红色）/P40（紫色）；比例尺，75 μm（G），以及LGALS3（绿色）/KLF4（红色）/P40（紫色）；比例尺，50 μm（H）。***，P ≤ 0.001；****，P ≤ 0.0001。

KRT13似乎在各模型和组织中标记hillock样状态，这可能具有诊断价值。为鉴定其他具有临床意义的标记物，我们寻求鉴定hillock富集的细胞表面标记物，作为抗体-药物偶联物（ADC）或双特异性T细胞衔接器的潜在靶点。TACSTD2（编码TROP2）是跨模型在hillock样细胞中富集的顶级细胞表面蛋白编码基因（图8D–F；补充图S10A–S10D和补充表S15），PSCA和CEACAM1亦然。TROP2 ADC近期已获批用于治疗乳腺癌和EGFR突变肺癌，并处于临床试验阶段（NCT02574455、NCT03901339、NCT07328490、TROPION-Lung等）。我们在SNL原发肿瘤中以蛋白水平验证了TROP2的表达，其在KRT13+ hillock样区域中富集，与P40+ basal细胞部分重叠（图8G）。Lgals3是顶级hillock富集基因（图8D–F；补充图S4A；补充表S6和S7）；虽然严格意义上不是细胞表面蛋白，但LGALS3是一种分泌型凝集素，可结合细胞表面的糖基化受体，并参与中性粒细胞募集和促肿瘤免疫的调控（86）。值得注意的是，靶向LGALS3的药物在早期临床试验中具有良好的安全性特征（87）。在SNL肿瘤中，LGALS3在hillock样区室中富集（图8H）。未来研究有必要验证这些靶点，并确定它们能否被利用来富集hillock样状态、评估其在患者样本中的存在和/或开发针对hillock样细胞的新疗法。讨论

在本研究中，我们在LUSC中鉴定了一种KRT13+ hillock样肿瘤细胞状态，该状态类似于正常气道hillock状态（25）。Hillock样肿瘤细胞存在于小鼠肿瘤、类器官和人类LUSC中，在其他鳞状恶性肿瘤中也观察到类似群体。这些发现支持一种模型，即鳞状肿瘤采用正常上皮细胞状态的转录程序，从而产生非遗传性异质性。我们的数据支持一种模型，即hillock样细胞代表一种basal来源的、分化程度更高且细胞周期更慢的状态。在正常气道中，hillock细胞在损伤后参与上皮保护和再生（4, 25）；在肿瘤中，类似的程序可能使细胞在应激下存活，同时保留可塑性。尽管hillock样细胞的丰度并不能预测LUSC患者的生存率（补充图S10E–S10H），但细胞状态间的动态转换、抽样变异性和肿瘤内异质性可能掩盖了其预后价值。我们发现，在SNL模型中，起源细胞影响hillock样程序。Club来源的肿瘤主要表现出管腔hillock样特征，而basal富集的背景则显示basal hillock样特征，这类似于谱系追踪研究将hillock细胞置于basal和club状态之间的发现（4, 5）。这些发现表明，谱系历史和表观遗传背景塑造了肿瘤进化过程中可及的细胞状态，这一原则在多种癌症类型中均有观察，包括SCLC（45）。在机制上，我们鉴定出KLF4是hillock样状态的关键调控因子。KLF4直接结合Krt13位点，并驱动一种在跨小鼠和人类背景下的hillock样群体中富集的保守转录程序。Hillock样细胞还表现出更广泛的免疫调控特征，这些特征不太可能仅由KLF4解释，提示存在其他调控因子。另一个候选因子是NRF2，它在LUSC中调控氧化应激、免疫微环境和治疗耐药性，这些特征均与hillock样细胞相关（27, 84, 88）。KLF4在体外促进顺铂和氧化应激耐药的发现支持了这一状态潜在的临床相关性。一个分裂较慢、抗应激的群体可能在细胞毒性治疗后存活，并通过可塑性促进肿瘤持续存在。这些发现与正常气道hillock细胞的抗损伤和再生特性（25）平行，提示癌症中对上皮修复程序的劫持利用。Hillock样程序还与富含髓系细胞的免疫背景相关，这在人类数据集和SNL肿瘤中均有观察（71）。TMPRSS11B是一种KLF4调控的、在Krt13+ hillock样细胞中富集的基因，它促进糖酵解代谢和乳酸外排，与低pH区域和固有免疫浸润相关（71）。干扰Tmprss11b的功能研究增加了CD4+ T细胞浸润并减少了肿瘤生长——这提供了一个示例，说明hillock相关基因如何改变肿瘤免疫微环境（70, 71）。未来研究应直接检验hillock样肿瘤细胞是否影响免疫募集或功能，以及这些相互作用是否影响免疫治疗反应。我们的分析突出了hillock样细胞中富集的标记物，包括TACSTD2/TROP2、CEACAM1、PSCA和LGALS3等表面相关靶点，这些需要进一步验证以选择性追踪、富集或靶向hillock样肿瘤细胞。这些发现表明，有效的LUSC治疗可能需要同时靶向增殖性basal样群体和支持可塑性、治疗耐药性和免疫调控的应激适应性hillock样状态。研究的局限性

我们的研究表明非遗传机制对LUSC的肿瘤内异质性有所贡献，且Krt13+ hillock样细胞可能在肿瘤进展中发挥作用，但我们承认存在若干局限性。

首先，我们的模型主要源自 SNL 转基因小鼠模型（GEMM），该模型复现了人类肺鳞状细胞癌（LUSC）的关键特征，但它是通过腺癌转分化产生的（26），可能与人体的某些肿瘤存在差异。尽管我们在其他模型和人类数据集中观察到了类似的 KRT13 阳性群体，但在更广泛的遗传背景下进行验证仍然很重要。仅依赖有限数量的转基因小鼠模型限制了我们对遗传改变如何影响丘状样状态的评估。我们的发现表明，细胞起源影响肿瘤内异质性，但需要额外的谱系特异性模型（例如，基底特异性驱动因子）来完全界定这些关系。我们无法在人类肿瘤数据集中清晰分辨腔面型与基底型丘状样状态，这可能是由于异质性增加以及基于聚类的方法存在局限性所致。使用更高深度或空间分辨的分析来改善分辨率，可能有助于澄清人类 LUSC 中是否存在不同的丘状样亚群。最后，候选调控因子和靶点的功能验证仍未完成。应在体内测试 KLF4 在化疗耐药中的作用，且在丘状样细胞中富集的候选表面标志物需要在蛋白水平上进行验证并评估其治疗可行性。

数据可用性

所有原始和处理数据均已通过基因表达综合数据库（GEO; RRID: SCR_005012）在超系列 GSE291730 下公开提供。来自 Wu 及其同事（47）的人类 LUSC 数据可在 GEO 中找到，登录代码为 GSE148071，来自 Kurten 及其同事（48）的头颈鳞状细胞癌（HNSCC）数据可在 GEO 中找到，登录代码为 GSE164690，来自 Zhang 及其同事（49）的食管鳞状细胞癌（ESCC）数据可在 GEO 中找到，登录代码为 GSE160269。

代码可用性

所有原始代码已存储于 GitHub（https://www.github.com/TGOliver-lab/Izzo_Hillock_2026），并已托管在 Zenodo（RRID: SCR_004129）上，包含处理后的 anndata 对象（https://doi.org/10.5281/zenodo.20315681）。如需重新分析本文报告的数据所需的其他信息，可向通讯作者索取。

作者披露信息

L.T. Izzo 报告称，在研究进行期间获得了美国癌症协会的资助。E.F. Patz Jr. 报告称，在本提交工作之外获得了 Grid Therapeutics 的其他支持。D.R. Tyson 报告称，D.R. Tyson 是 VRise Therapeutics 科学咨询委员会的成员。T.G. Oliver 报告称，在研究进行期间获得了 NIH/NCI、北卡罗来纳州肺癌倡议和美国癌症协会的资助，以及来自杜克科学与技术研究计划的其他支持；此外，还获得了 AACR Senior Editor、Genes & Development Consulting Editor、Light Horse Therapeutics、Nuage Therapeutics 和 LiveLung 的个人费用；来自 Auron Therapeutics 的个人费用和非财务支持；以及来自 Caris Life Sciences 的其他支持（在本提交工作之外）。此外，T.G. Oliver 拥有一项已颁发的小细胞肺癌（SCLC）亚型专利 US11,124,841B2。其他作者未报告披露信息。

作者贡献

L.T. Izzo：构思，数据整理，软件，形式分析，资金获取，验证，调查，可视化，方法学，撰写—原始草稿，撰写—审查和编辑。T. Reyes：数据整理，软件，形式分析，验证，调查，可视化，方法学，撰写—原始草稿。S. Meesala：调查，撰写—审查和编辑。A.S. Ireland：数据整理，软件，形式分析，调查，可视化，方法学，撰写—审查和编辑。L.B. Earnest-Noble：调查，撰写—审查和编辑。S. Yang：调查。H.S. Sunil：形式分析，调查。X.C. Cheng：调查。N. Tserentsoodol：调查。S.B. Hawgood：调查。C. Glass：形式分析，方法学。E.F. Patz Jr：资源。B.L. Witt：形式分析。D.R. Tyson：数据整理，软件，形式分析，验证，方法学，撰写—审查和编辑。K.A. O'Donnell：构思，监督，资金获取，项目管理，撰写—审查和编辑。T.G. Oliver：构思，形式分析，监督，资金获取，方法学，撰写—原始草稿，项目管理，撰写—审查和编辑。

致谢

我们感谢 Oliver 实验室成员提供的技术协助（K.S. Lucas, D. Soltero, K. Spainhower, and R. Uzachenko）和行政支持（X.C. Cheng, L. Houston, and L. Youngblood）。我们感谢 Greg Wang 博士实验室提供的 CUT&RUN 专业知识（Y. Guo），感谢 MedGenome 提供的测序服务，感谢杜克癌症研究所（DCI）流式细胞术核心实验室和杜克人类疫苗研究所提供的 TapeStation 使用服务。我们感谢 NIH NCI 在拨款 U24-CA213274, R01-CA244841, 和 R01-CA187457（T.G. Oliver）；F31-CA275295（A.S. Ireland）下的支持；感谢国家聋人及沟通障碍研究所（R25-DC020172; L.B. Earnest-Noble）；美国癌症协会（PF-25-1366291-01-PFCBI; L.T. Izzo）；北卡罗来纳州肺癌倡议；以及杜克科学与技术奖学金基金（T.G. Oliver）的支持。K.A. O'Donnell 获得了 NCI R01CA273585, P50CA70907, V Foundation（T2021-011）, 美国肺脏协会 Courtney Cox Cole 肺癌研究奖（LCD1421064），以及国防部（DoD-LC190249）的支持。我们感谢杜克大学医学院和 DCI 的共享资源—生物存储与精准病理中心，该中心获得癌症中心支持拨款（P30-CA014236）和合作人类组织网络（UM1-CA239755）的支持。

注：本文的补充数据可在 Cancer Research Online（http://cancerres.aacrjournals.org/）获取。