高DDR1免疫反应性与CD8+ T细胞减少相关...

《Cancer Research Communications》：High DDR1 immunoreactivity is associated with decreased CD8+ T-c...

　　

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摘要

免疫检查点阻断（ICB）是治疗微卫星不稳定性高（MSI-H）且CD8+ T细胞高度浸润的结直肠癌的有效方法。微卫星稳定（MSS）结直肠癌对ICB无效，部分原因是瘤内CD8+ T细胞匮乏。我们最近确定了盘状结构域受体1（DDR1）是与MSS结直肠癌中CD8+ T细胞排斥相关的四个基因之一。关于DDR1的切割细胞外结构域（cECD）在乳腺癌和胰腺癌小鼠模型中是否存在及其作用，目前存在相互矛盾的报告。为了探讨DDR1 cECD在人类结直肠癌中的作用，我们开发了胶原排列和空间转录组学分析（CASTA），结果显示参与成纤维细胞收缩性的基因与DDR1的肿瘤表达和由肿瘤胶原的无标记二次谐波产生（2HG）成像确定的胶原排列有关。使用结直肠癌球体和成纤维细胞的三维胶原共培养体系，我们证明DDR1促进胶原排列和CD8+ T细胞排斥。我们在MSS结直肠癌超级微粒中发现大量DDR1 cECD，这是一种25至35纳米的分泌性无膜纳米颗粒。含有DDR1 cECD的超级微粒足以诱导人结肠成纤维细胞收缩。我们提出一个模型，即含有DDR1 cECD的超级微粒促进MSS结直肠癌中基质成纤维细胞的收缩，从而导致胶原排列和CD8+ T细胞排斥。这些结果支持DDR1 cECD作为MSS结直肠癌中的诱人治疗靶点。

意义：在人类结直肠癌中，含有DDR1细胞外结构域的超级微粒促进成纤维细胞收缩和胶原排列，从而排斥瘤内CD8+ T细胞。

引言

免疫检查点阻断（ICB）代表结直肠癌治疗领域的重大临床进展，可实现持久缓解（1）。然而，ICB的疗效仅限于15%的微卫星不稳定性高（MSI-H）结直肠癌患者，其特征是瘤内细胞毒性CD8+ T细胞浸润（2）。其余85%的微卫星稳定（MSS）结直肠癌患者对ICB无反应（3）。MSI-H结直肠癌中CD8+ T细胞浸润增加通常归因于突变负荷增加，导致新抗原呈递增加（4）。这一模型可被解释为MSS结直肠癌使用ICB不可行，因为MSS结直肠癌突变较少。然而，最近的研究挑战了这一假设（4）。我们最近发现，在MSI-H结直肠癌前驱病变中，CD8+ T细胞浸润增加先于高突变发生，表明高突变对于高CD8+ T细胞浸润并非必需（2, 5）。此外，突变负荷低的肿瘤也呈递新抗原，例如通过转录新开放阅读框，导致隐蔽新抗原的呈递（6, 7）。因此，一种增加CD8+ T细胞向MSS结直肠癌肿瘤浸润的方法，有望增加符合条件的ICB患者数量。我们最近描述了一个与MSS结直肠癌中CD8+ T细胞排斥相关的四基因特征（8）。其中一个基因编码盘状结构域受体1（DDR1），这是一种受体酪氨酸激酶（RTK），在与纤维状和非纤维状胶原结合后被激活（9, 10）。据报道，这种结合与DDR1在其细胞外近膜区域的蛋白酶解切割偶联，导致切割后的细胞外结构域（cECD）释放到细胞外空间（11–13）。DDR1已被证明参与免疫调节（14–20）以及结肠纤维化（21），使其成为进一步研究的有吸引力的候选分子。在小鼠乳腺癌异种移植中，DDR1表达导致细胞外胶原纤维排列增加，从而导致CD8+ T细胞排斥（22, 23）。在该模型中，DDR1 cECD足以引起排斥，表明DDR1通过激酶非依赖性、非细胞自主性机制调节胶原重塑。进一步研究显示DDR1在胰腺癌中也具有促癌作用。然而，DDR1表达与胶原排列增加无关，且未检测到cECD，提示DDR1可能通过不同机制在不同癌症类型中促进癌症（24）。尽管DDR1在结直肠癌CD8+ T细胞排斥中的作用已被研究，但相关研究侧重于全长DDR1，未探讨DDR1 cECD在胶原排列中的作用，且仅限于MSI-H小鼠异种移植模型（14）。因此，我们试图探讨DDR1 cECD在促进人类结直肠癌CD8+ T细胞排斥中的潜在作用，重点关注其对胶原排列的影响。重组DDR1细胞外结构域可在体外促进胶原组织（25）。然而，DDR1 cECD如何在肿瘤环境中引起胶原排列尚不清楚。因此，本研究的重点是更好地理解DDR1 cECD如何在结直肠癌中在体内促进胶原排列。我们发现分泌的DDR1 cECD主要存在于MSS结直肠癌超级微粒中，超级微粒是我们几年前发现的25至35纳米无膜分泌性纳米颗粒（26）。为了调查与人类结直肠癌肿瘤中胶原排列相关的基因、通路和细胞类型，我们开发了胶原排列和空间转录组学分析（CASTA）。将该方法应用于五个MSS结直肠癌肿瘤组织块，我们发现肿瘤DDR1表达和胶原排列与基质中参与细胞收缩性的成纤维细胞基因表达增加有关。我们随后开发了一个三维结直肠癌球体/成纤维细胞/T细胞共培养体系，用以证明结直肠癌细胞释放的含有DDR1 cECD的超级微粒促进胶原排列、成纤维细胞收缩性以及CD8+但非CD4+ T细胞排斥。我们提出一个模型，即DDR1 cECD以超级微粒形式从结直肠癌细胞中释放，导致成纤维细胞收缩性增加，进而引起胶原排列和CD8+ T细胞排斥。

材料与方法

细胞

DiFi细胞是在Coffey实验室开发的女性MSS结直肠癌细胞系（RRID: CVCL_6895; ref. 27）。囊性克隆3（CC-3）、刺状克隆1（SC-1）和西妥昔单抗耐药囊性克隆（CC-CR）细胞系是从ATCC获得的HCA-7细胞中先前衍生出的克隆（28, 29）。其他结直肠癌细胞系从ATCC获得。成纤维细胞系先前从一名遗传性非息肉病性结直肠癌（HNPCC）患者和一名散发性结直肠癌患者（HCF）的远端手术切除边缘分离获得（30）。实验前对细胞进行支原体检测。细胞系鉴定通过短串联重复分型进行。原代成纤维细胞从同意参加研究的患者的结直肠癌和腺瘤切除的邻近正常组织中分离获得，于范德堡大学医学中心（VUMC；机构审查委员会方案IRB #151721），使用改编自Rockman等人的方法（31）。分离结肠隐窝后，将组织切碎并放入含有15%牛生长血清的完全培养基中（见"二维细胞培养"部分），置于10厘米培养皿中。待成纤维细胞贴附后，去除剩余组织。成纤维细胞分离在Primocin存在下进行，以防止支原体污染。每3至4天更换一次培养基。CD4+和CD8+ T细胞从ATCC购买的（cat. #PCS-800-012，批号80204253）健康供者外周血单个核细胞中回收。细胞用FITC标记的抗人CD3（BioLegend，344815）、CD4（BioLegend，317407）和CD8（BioLegend，100733）抗体在FACS缓冲液（含2% FBS和2 mmol/L乙二胺四乙酸的PBS）中于4°C染色15分钟，用PBS洗涤，350 × g离心5分钟，最后重悬于FACS缓冲液中。使用BD FACSMelody（BD Biosciences）分选CD4+和CD8+细胞。分选后的CD8+和CD4+ T细胞在350 × g下沉淀，重悬于含重组人IL2（Thermo Fisher Scientific）的ImmunoCult人CD3/CD28 T细胞激活剂（ImmunoCult-XF T细胞扩增培养基，STEMCELL Technologies）中。

二维细胞培养

结直肠癌细胞系和成纤维细胞在DMEM（Corning，10-017-CV）中培养，补充10%牛生长血清（结直肠癌细胞系、HNPCC和HCF）或15%牛生长血清（原代成纤维细胞）（Cytiva，SH3054.03）、100×非必需氨基酸（Cytiva，SH30238.01）、200 μmol/L L-谷氨酰胺（Cytiva，SH30034.01）以及10 U/mL青霉素-链霉素（Cytiva，SV30010）。细胞系每2至3天传代一次。原代成纤维细胞在约80%汇合时传代。实验在细胞解冻后传代2至5代后进行。

细胞培养基分级

为准备大量无血清条件培养基用于从DiFi细胞中进行分级，使用中空纤维生物反应器，如前所述（32）。反应器装入1至5×10? DiFi细胞。使用每天1至2毫克葡萄糖的消耗量确认细胞已达到平衡生长期。采集培养基并按前述方法处理（32, 33）。为去除细胞碎片，每批收获的20 mL条件培养基先以250 × g离心，然后以2,500 × g离心10分钟，并经Millex 0.22 μm孔径注射器滤器（MilliporeSigma）重力过滤。每个池分为60 mL等份，在分级前于4°C保存。培养基按细胞外囊泡（EV）沉淀物、外泌体和超级微粒分级，通过超速离心完成，如前所述（34），以便定量不同分级中的DDR1。快速蛋白液相色谱-体积排阻色谱（FPLC-SEC）用于制备用于处理实验的超级微粒，如前所述（34）。我们先前已证明，通过超速离心或FPLC-SEC分离的超级微粒含有相似水平的DDR1 cECD（34）。

DiFi细胞中DDR1敲除

为在DiFi细胞中敲除DDR1，从MilliporeSigma购买含有嘌呤霉素抗性、GFP、Cas9和DDR1敲除（KO）以及非靶向对照单链向导RNA（sgRNA）序列的慢病毒（人DDR1 KO sgRNA序列：GTAACGCGAGCCGGTAGCTC）。为转导细胞，将25 μL病毒加入15 mL含5% FBS并补充1.2 μg/mL聚凝胺的培养基中，用于处理亲本DiFi细胞。静置5天后，DiFi细胞用递增浓度的嘌呤霉素处理。通过BD Biosciences Aria III基于GFP表达进行FACS分选，以产生DDR1 KO和DDR1表达对照克隆。通过免疫印迹和通过分解追踪插入缺失（TIDE）检测在克隆中验证DDR1成功敲除。

TIDE检测

为在基因组水平验证DDR1 KO，使用Qiagen DNeasy血液与组织试剂盒（69506）从DDR1表达对照和DDR1 KO DiFi克隆中分离基因组DNA。通过PCR扩增CRISPR靶位点周围序列（引物序列：GCTCCTGGGACCTCTACTTC和CAGGGGAGGAGCAGGTTTAG）。通过Qiagen PCR纯化试剂盒（28104）分离扩增产物，并提交给GenHunter使用相同引物进行Sanger测序。每个克隆进行三次测序。将序列色谱图上传至https://tide.nki.nl/以定量DDR1 KO效率和KO等位基因混合情况。

CellTiter-Glo细胞活力检测

为测试DiFi细胞在三维培养中的活力，将500个DiFi细胞悬浮于5 μL胶原I/Matrigel圆顶中（描述见"三维结直肠癌球体/成纤维细胞共文化"部分），接种于白色壁96孔板（Greiner Bio-One，655098）中。测量时，向每孔加入100 μL CellTiter-Glo试剂（Promega，G7572）。摇动10分钟后，使用Synergy H1酶标仪读取发光值。进行三个生物学重复，每个包含八个技术重复。

三维结直肠癌球体/成纤维细胞共培养

球体/成纤维细胞共培养方法基于Strating等人先前描述的方法（35），并作以下修改。将DiFi细胞用胰蛋白酶消化，用18号针头抽吸5次，使用Bio-Rad TC20自动细胞计数器计数。将细胞重悬于20% Matrigel（Corning，354234）、1.25 mg/mL胶原I（Corning，354249）、5×中和缓冲液[α最小必需培养基（Gibco，12561-056）中0.1 mol/L 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸和2% NaHCO?]和无血清培养基（见"二维细胞培养"方法）的混合物中。三维培养凝胶组成通过测试一系列胶原I和Matrigel浓度进行优化。所用凝胶组成允许成纤维细胞与圆顶表面的最佳贴附和凝胶收缩性。将含有2,000个DiFi细胞的35 μL凝胶圆顶接种于24孔玻璃底培养板（MatTek，P24G-0-13-F）上。预实验发现初始胶原结构对聚合温度极其敏感，此发现先前已有报道（36）。

当穹顶在完成接种后立即转入培养箱时，先接种的穹顶所呈现的胶原组织结构与后接种的穹顶明显不同。为解决这一问题，接种后的穹顶在室温下允许聚合1小时，然后再加入室温培养基并转入细胞培养箱。DiFi细胞培养13天，直到球体形成。在进行混合培养以定量胶原对齐之前，成纤维细胞先用1:200的CellBrite红色染料（Biotium，30023）在37°C悬浮状态下染色20分钟，随后洗涤并计数。在比较DDR1表达对照组和DDR1敲除DiFi细胞的实验中，每个孔直接加入12,000个成纤维细胞。在需要加入supermeres的实验中，先将supermeres用培养基稀释至0.2 mg/mL，并通过0.22 μm注射器过滤器进行无菌过滤。然后将稀释后的supermeres用于重悬成纤维细胞，再加入球体中。成纤维细胞加入后，混合培养继续培养6天，随后进行第二次谐波产生（2HG）成像。在T细胞侵袭实验中，成纤维细胞加入7天后将穹顶转移至含新鲜培养基的新培养板中，以减少培养基中积累因子对侵袭的影响。CD4+或CD8+ T细胞按"细胞"部分所述方法进行分选，并在穹顶转移至新孔后立即加入。在未加成纤维细胞的实验中，球体培养20天。在未加DiFi细胞的实验中，穹顶在室温下聚合1小时后直接加入成纤维细胞。收缩实验

为了测量成纤维细胞的收缩性，将300个成纤维细胞悬浮于5 μL胶原I/Matrigel穹顶中，接种于96孔低黏附培养板（Falcon，351172）上，在室温下静置1小时，然后加入室温培养基。每个穹顶中成纤维细胞的数量经过选择，使其在未经supermere处理时产生中等程度的收缩。通过将HNPCC细胞系用0至0.2 mg/mL范围内的supermeres处理来确定最佳supermere浓度（补充图S6）。由于0.2 mg/mL浓度产生了最大效应，该浓度被选用于所有实验。PRTH101最初由Incendia Therapeutics开发，已进行合成。在supermeres与PRTH101或同型对照抗体（Bio X Cell，BE0297）预孵育的实验中，先将supermeres在培养基中稀释至0.2 mg/mL并进行无菌过滤，然后加入10 μg/mL的抗体。Supermere-抗体混合物在37°C摇床上孵育1小时后再加入成纤维细胞培养物中。为确保穹顶与培养板的黏附不会抑制收缩，用枪头轻轻将穹顶从培养板上脱离。接种后36小时内每隔3小时使用MuviCyte进行成像。使用ImageJ（RRID：SCR_003070）测量穹顶直径。在第一个时间点形状不规则或位置导致无法测量直径的穹顶被排除在分析之外。由于直径测量具有客观性，执行分析的个体未对实验条件进行盲法处理。每个实验条件使用N = 3至10个技术重复。对于生物学重复，使用了两种成纤维细胞系（HNPCC和HCF）和三种患者来源的原代成纤维细胞（患者6-8；患者信息见补充表S2）。选择原代成纤维细胞时确保男女均有代表。

三维培养中胶原的2HG成像

为了对三维培养中的胶原进行成像，凝胶在4%多聚甲醛（PFA）PBS中固定10分钟，并在PBS中洗涤2次。将穹顶从培养板上取下，使用氰基丙烯酸酯基粘合剂固定在10 cm培养皿底部，并浸泡在PBS中。使用Nikon AX多光子显微镜，以880 nm激发波长，25×油浸物镜采集图像。信号在440 nm的DAPI通道中采集。Z轴堆栈包含600至650个切片，从穹顶表面开始，切片间距为0.3 μm。每个穹顶采集四张图像。使用ImageJ的OrientationJ插件（RRID：SCR_014796）定量胶原一致性。对所有Z切片的平均对齐度进行定量，以捕获侵袭T细胞在特定距离内所遇到的总胶原对齐量。每个实验条件下使用三个生物学重复，每个重复含三个技术重复。由于图像分析完全自动化，执行分析的个体未对实验条件进行盲法处理。T细胞侵袭实验

在加入T细胞之前，含或不含成纤维细胞的DiFi球体按"三维结直肠癌球体/成纤维细胞混合培养"部分所述进行三维培养。从开始培养20天后加入T细胞。CD8+和CD4+ T细胞用1:200 CellBrite红色染料（Biotium，30023）在37°C悬浮状态下染色20分钟，随后洗涤并计数。将穹顶转移至含新鲜培养基的新24孔板中。每个孔加入5万个CD8+或CD4+ T细胞。24小时后，将穹顶转移至新培养板并用PBS洗涤，去除未侵入穹顶的细胞。将穹顶在4% PFA PBS中固定10分钟，并在PBS中洗涤2次。为定量T细胞的侵袭，通过荧光透射和微分干涉差（DIC）观察穹顶，由未设盲的个体手动计数每个DiFi球体内CellBrite阳性细胞的数量。为确保仅计入已成功穿透周围胶原进入穹顶的T细胞，分析仅限于完全包含在穹顶内的球体。每个条件下使用三个生物学重复，每个重复含三个技术重复。人福尔马林固定石蜡包埋样本

用于CASTA分析并附有病理报告的福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织微阵列（TMA）由71例微卫星稳定（MSS）结直肠癌肿瘤患者的1 mm组织芯组成，另有5例原代人FFPE结直肠癌样本，均通过协作人体组织网络（CHTN；IRB #101531；见补充表S1和S2）获取。样本使用遵循VUMC伦理委员会规定。作为生物学变量的性别与年龄

根据胶原组织结构具有年龄和性别特异性的报告（参考文献37），为结直肠癌TMA、CASTA分析和正常成纤维细胞的分离，选择了涵盖不同年龄段和两种性别的患者样本（患者数据见补充表S1和S2）。用于CASTA的样本筛选仅限于病理学判定基质比例较高的MSS肿瘤。该数据集允许识别与DDR1表达和胶原对齐相关的基因。然而，仅使用5个样本无法从这些数据中得出群体水平的结论。多重免疫荧光

使用GE Cell Dive对结直肠癌TMA进行循环染色，方法如前所述（参考文献5）。所用抗体包括全角蛋白Alexa Fluor 488直接偶联抗体（Santa Cruz Biotechnology，53-9003-82）、CD8 Alexa Fluor 647直接偶联抗体（BioLegend，13983）和CD4 Alexa Fluor 647直接偶联抗体（Abcam，ab133616）。为标记DDR1，D1G6单克隆抗体（mAb；Cell Signaling Technology，5583）由Cell Signaling Technology直接偶联至Alexa Fluor 555。使用ilastik基于PanCK通道生成上皮掩膜，将322个位点的图像中的上皮区域分离出来。DDR1免疫反应性在ImageJ（RRID：SCR_003070）中以平均荧光强度定量。CD8+和CD4+ T细胞由对DDR1表达设盲的个体手动计数。肿瘤被分为DDR1低表达和高表达两组，分别代表上皮DDR1免疫反应性范围的较低半组和较高半组。DDR1低表达和高表达肿瘤中CD8+和CD4+ T细胞浸润差异的统计显著性通过非参数数据的Wilcox检验确定。参数数据使用Student t检验。免疫印迹

为评估DDR1水平，细胞在约80%汇合度时使用Cell Signaling Technology裂解缓冲液（9803）进行裂解，在台式离心机中13,000 RPM离心6分钟，并在4°C下超声处理20秒。加入上样缓冲液后，样品在9% SDS-PAGE凝胶中分离，转膜至硝酸纤维素膜，使用1:1,000 Cell Signaling Technology DDR1 D1G6 mAb（靶向DDR1 C端，5583）进行封闭探测，方法如前所述（参考文献18）。在某些实验中，血清饥饿的DiFi细胞用溶剂（20 mmol/L乙酸）或50 μg/mL胶原I（溶于20 mmol/L乙酸，Corning，354249）处理。24小时后，通过免疫印迹使用1:1,000 Cell Signaling Technology抗DDR1 pY513抗体（14531S）分析细胞裂解物中磷酸化DDR1的水平。抗β-actin 1:2,000用作上样对照（Sigma-Aldrich，A5318）。为检测条件培养基中的DDR1 cECD，向条件培养基中加入10%三氯乙酸，在冰上放置30分钟以沉淀蛋白。样品在10,000 × g下离心10分钟收集沉淀，用冷丙酮洗涤2次后重悬于裂解缓冲液中，并上样至SDS-PAGE凝胶中。为检测分泌组分中的DDR1 cECD，在加入SDS-PAGE上样缓冲液之前不对样品进行额外预处理。为检测DDR1 cECD，Western blot使用Odyssey Intercept（TBS）封闭缓冲液（927-60001）封闭，并使用1:1,000 R&D抗DDR1 N端抗体（AF2396）进行探测。作为上样对照，使用Ponceau S染色（Sigma-Aldrich，P7170）。所有Western blot均使用1:5,000 LI-COR Odyssey二抗进行探测，并使用Odyssey XF成像系统进行成像。酶联免疫吸附测定

为通过酶联免疫吸附测定（ELISA）定量条件培养基和分泌组分中的DDR1 cECD，按照制造商说明使用Human DDR1 SimpleStep ELISA试剂盒（abcam，ab260063）。DiFi条件培养基在加入前按1:64稀释。为确定分泌组分中DDR1的相对含量，DiFi条件培养基先在100 kDa离心滤器（MilliporeSigma，UFC71008）中离心浓缩，并按前述方法进行超速离心分级。为完全统计条件培养基中所有DDR1，浓缩步骤的滤过液和supermere上清液也被收集并通过ELISA分析。测量各分组的蛋白浓度和体积，用于计算各组中无细胞DDR1占总分泌蛋白的百分比。为获得线性范围内的结果，分别加入0.122 mg EVs、0.234 mg exomeres和0.125 μg supermeres。滤过液和supermere上清液按1:2稀释。每个ELISA测量进行三个技术重复。CASTA

使用切片机从五个人类FFPE结直肠癌肿瘤组织块上先切取30 μm初始切片，随后连续切取5 μm切片。5 μm切片由CytAssist转移至空间转录组切片（10x Genomics，100466）上，并按标准Visium v2方案进行处理，该方案提供约50 μm的分辨率。RNA测序使用NovaSeq X系列平台，采用双端读取，目标为每样品1.25亿次读取。使用Space Ranger进行比对，并使用Loupe Browser进行基准标记对齐。为对胶原进行成像，将30 μm切片进行脱蜡、复水，并在由50%甘油和50% PBS组成的封片剂中盖片。使用Nikon AX MP显微镜在880 nm激发波长下，通过25×物镜进行2HG成像。Z切片间距为7 μm，图像沿切片进行拼接。所得图像经拼接后进行Z轴投影。为确定每个区域的对齐量，使用内部宏改编的OrientationJ ImageJ插件，量化图像每个区域的一致性。由于胶原对齐发生在比目标对齐热图分辨率更大的尺度上，该宏基于图像周围200 μm范围内的信息将一致性值分配给像素。热图和Visium数据通过利用napari Python插件（RRID：SCR_022765）的内部流程进行配准。为将Visium位点分为上皮和基质，使用R语言中的Seurat包（RRID：SCR_007322）从每个样品的位点中生成UMAP降维聚类。根据这些聚类与苏木精-伊红（H&E）图像的重叠情况，将它们归为上皮、基质或模糊三类。

用于比较基质中的基因表达和胶原对齐与邻近上皮中DDR1表达的分析，使用了紧邻上皮斑点的基质斑点子集。为了识别与邻近上皮的对齐和DDR1表达相关的基因，使用Python中的SciPy包（RRID: SCR_008058）为每个基因计算了Spearman ρ值和Bonferroni校正P值。绘图与统计分析

所有图表均在R中使用ggplot2包（RRID: SCR_014601）制作。趋势线代表线性回归模型。统计分析使用rstatix（RRID: SCR_021240）和ggpubr（RRID: SCR_021139）包进行。对于两个样本的比较，采用Student t检验（用于参数数据）和Wilcoxon检验（用于非参数数据）。当比较多个样本时，使用ANOVA，并在比较所有样本时进行Tukey事后检验，在与对照组比较多个样本时使用Dunnett检验。P值<0.05被认为是显著的。

结果

MSS结直肠癌中DDR1表达与CD8+ T细胞浸润减少相关

我们之前报道DDR1基因表达与MSS结直肠癌中CD8A基因表达降低相关（8）。由于DDR1蛋白丰度在翻译后水平受到调控（13, 38, 39），DDR1 mRNA和蛋白水平可能并不完全相关。因此，我们使用CD8和DDR1抗体进行免疫荧光（IF），评估了结直肠癌TMA中71个人类MSS结直肠癌样本的DDR1免疫染色和CD8+ T细胞向肿瘤实质内的浸润情况。与之前的报道一致，DDR1免疫反应性主要局限于上皮（图1A；参考文献40, 41）。CD8+ T细胞向肿瘤上皮的浸润是有效ICB的先决条件。因此，分析需要区分上皮内和基质中的CD8+ T细胞。因此，我们对IF染色的TMA样本进行了上皮和基质分割，仅分析上皮区域，即DDR1主要表达的区域。

图1. 高分辨DDR1免疫反应性与MSS结直肠癌中CD8+ T细胞浸润减少相关。A，三个来自MSS结直肠癌TMA的1毫米肿瘤核心中DDR1、CD8、PanCK和DAPI免疫荧光的代表性图像，根据上皮DDR1荧光强度分为DDR1低表达和高表达。上皮区域以虚线白线标出。上皮内CD8+ T细胞由白色箭头标记。比例尺，200 μm。B和C，每个DDR1低表达和高表达MSS肿瘤样本中每个上皮区域相对CD8+（B）和CD4+（C）T细胞数量的海盗图。每个点代表1个肿瘤的平均值。N = 58 DDR1低表达和13 DDR1高表达患者。ns，无统计学显著性；*，P < 0.05。

DDR1低表达的MSS肿瘤每个上皮区域的CD8+ T细胞数量显著高于DDR1高表达的MSS肿瘤（图1A和B；补充图S1）。重要的是，T细胞浸润与DDR1之间的关系仅限于CD8+ T细胞，因为DDR1低表达和高表达的MSS结直肠癌样本之间CD4+ T细胞计数没有变化（图1C；补充图S1）。

在人类结直肠癌样本中识别与胶原对齐和上皮DDR1表达相关的基因

在建立了DDR1表达与MSS结直肠癌中肿瘤内CD8+ T细胞浸润之间的反向关系之后，我们接下来旨在识别可能参与DDR1介导的胶原对齐的基因、通路和细胞类型。由于DDR1被发现能促进胶原对齐，从而阻碍CD8+ T细胞向肿瘤实质内的浸润（22），我们试图确定结直肠癌中上皮DDR1表达是否与基质中增加的胶原对齐相关。为此，我们开发了CASTA方法，用于研究人类结直肠癌样本中DDR1与胶原对齐之间的关系，该方法能够捕捉胶原对齐与基因表达之间的空间关系（图2A）。该方法中，五个人类FFPE MSS结直肠癌肿瘤组织块（参见补充表S1了解这五位患者的临床特征）被切成连续切片，第一张切片为30 μm，后续切片为5 μm。第一张切片通过2HG成像（图2B）。基于每个区域中胶原的相干性测量生成胶原对齐的空间图谱（图2C）。相邻的连续切片经过标准Visium v2空间转录组学处理，然后与胶原对齐数据进行合并（图2A）。生成的数据集整合了肿瘤中基因表达和胶原对齐的空间分辨信息。

图2. 结直肠癌中与DDR1和胶原对齐相关的基质基因。A，CASTA示意图。B，患者1肿瘤样本的全切片2HG代表性图像。比例尺，1 mm（左）和400 μm（插图）。C，患者1肿瘤样本的胶原相干性热图。D，基质斑点和上皮斑点中胶原相干性的海盗图。每个点是1个Visium斑点。****，P < 0.0001。E，每个基因与基质胶原相干性和邻近上皮中DDR1表达的相关性。正相关基因且校正P < 0.05的以蓝色高亮显示。F，E中识别基因的Gene Ontology术语。与收缩相关的本体以粗体显示。G，两个或更多样本中与DDR1表达相关的基质基因的重叠。H，两个或更多样本中与DDR1相关的基质基因的Gene Ontology术语。与收缩相关的本体以粗体显示。患者数据见补充表S1。

在Sun等人描述的乳腺癌小鼠模型（22）中，基质中对齐的胶原屏障包围着肿瘤上皮，阻碍了CD8+ T细胞的接近。与该组的发现一致，比较基质斑点和上皮斑点的胶原对齐显示，对齐的胶原确实主要位于周围基质而非肿瘤上皮本身（图2D）。鉴于DDR1 cECD从DDR1表达的肿瘤细胞脱落，我们推断如果DDR1 cECD导致胶原对齐，那么在对齐DDR1表达上皮的邻近区域，对齐程度最高。确定DDR1表达与胶原对齐之间相关性时的一个挑战是如何将空间上分离的上皮DDR1表达和基质胶原对齐进行关联。为了克服这一挑战，分析仅限于与肿瘤上皮接壤的基质斑点，并且DDR1水平量化为最近上皮斑点中的DDR1表达量（补充图S2A）。我们首先使用此分析确认上皮斑点中的DDR1表达与相邻基质斑点中增加的胶原对齐相关，通过汇集所有五个患者样本的斑点（补充图S2B）。我们接下来生成了一个在所有样本中基质区域与邻近上皮中DDR1以及胶原对齐正相关的基因列表（图2E）。识别出的基因富集于成纤维细胞表达的基因，并与细胞收缩力和细胞骨架组织相关，如平滑肌α2肌动蛋白和波形蛋白（图2E和F）。我们还生成了一个与DDR1表达和胶原对齐相关的上皮基因列表（补充图S3C）。虽然识别了一些基因，但未发现统计学上显著的基因本体，这表明DDR1表达、胶原对齐与收缩相关基因表达之间的关联特异于基质。虽然汇集所有五个样本揭示了哪些基因与DDR1表达和胶原对齐在人群中相关，但某个与特定基因强相关而在其他样本中不相关的个体样本有潜在混淆分析的可能。例如，我们发现只有患者1和2的胶原对齐与血小板激活基因本体相关（补充图S3A）。因此，我们对每个样本分别重复了分析（补充图S3A和S3B）。我们识别出样本间共享的重叠相关基因和基因本体（图2G和H；补充图S3A和S3B）。然而，并非所有样本都共享与DDR1表达或胶原对齐相关的基因本体。这主要是由于一些样本中与DDR1表达和胶原对齐相关的总基因数量较少，以及识别出的本体存在差异。虽然五个样本不足以得出关于基因与DDR1表达和胶原对齐关联的广泛结论，但与细胞收缩力相关的本体在大多数样本中都很常见（补充图S3A和S3B）。为了识别与DDR1表达和胶原对齐关联的最常见本体，我们将分析集中在共享的本体上。至少两个样本间重叠的DDR1相关基因的基因本体富集于与细胞-基质粘附、细胞收缩调控和运动相关的基因（图2H）。总之，CASTA能够捕捉每个样本中与胶原对齐和DDR1表达相关的多样化基因程序。这些结果表明，与胶原对齐和DDR1表达相关的基因表达变化主要由成纤维细胞表达的基因组成，涉及收缩力、运动及相关过程。

DiFi类器官/成纤维细胞共培养中DDR1敲除导致胶原对齐和CD8+ T细胞浸润减少

基于CASTA数据表明DDR1表达和胶原对齐与成纤维细胞收缩相关，我们开发了一种共培养体系，其中可以测量人类结癌细胞表达的DDR1对成纤维细胞在胶原对齐和T细胞浸润方面的影响。我们通过免疫印迹评估了人类结癌细胞系的DDR1表达（图3A；补充图S4A），并选择了DiFi细胞用于我们的共培养体系，因为它们表达DDR1，是MSS结直肠癌细胞系，且具有经过充分表征的分泌组（26, 34）。为了确定DDR1在DiFi细胞中是否具有功能性，我们用I型胶原处理细胞并观察到DDR1自磷酸化（补充图S4B）。

图3. DDR1表达的DiFi类器官与原发性正常患者来源的成纤维细胞共培养促进3D共培养中的胶原对齐。A，结癌细胞系中DDR1的免疫印迹。B，DiFi类器官/成纤维细胞共培养方法的示意图。C，DiFi类器官（黄色，虚线青色轮廓）和成纤维细胞（洋红色）共培养的代表性透射荧光图像。比例尺，200 μm。D和E，含有成纤维细胞和DDR1表达或DDR1敲除DiFi类器官的胶原/Matrigel穹顶的2HG图像z投影和胶原相干性海盗图的代表性图像。白色箭头指向对齐胶原的区域。白色S表示DiFi类器官。比例尺，100 μm。每个点代表单个穹顶的平均相干性。ns，无统计学显著性；**，P < 0.01。N = 9个穹顶。

C，DiFi球体（黄色，虚线青色轮廓）和成纤维细胞（洋红色）共培养的代表性表面荧光图像。比例尺，200 μm。D和E，含有成纤维细胞以及表达DDR1或DDR1敲除的DiFi球体的胶原蛋白/Matrigel穹顶中，2HG图像的代表性z投影图和胶原蛋白相干性的海盗图。白色箭头指向胶原蛋白排列区域。白色S表示DiFi球体。比例尺，100 μm。每个点代表单个穹顶的平均相干性。ns，无统计学意义；**，P < 0.01。N = 9个穹顶。

图3关闭。我们接下来通过CRISPR-Cas9生成了DDR1敲除的DiFi细胞。通过免疫印迹和TIDE检测验证了DDR1的消除（补充图S4C和S4D）。由于细胞生长率可能是混杂变量，我们测量了在胶原蛋白I和Matrigel混合物中培养的DDR1敲除和表达DDR1的非靶向对照DiFi克隆的细胞活力（见"材料与方法"）。我们确定了DDR1敲除DiFi克隆B，其生长速率与表达DDR1的克隆相似（补充图S4E），随后用于后续实验。为了在体外模型中测量DDR1对胶原蛋白排列和CD8+ T细胞浸润的影响，我们改编了一种最初用于类器官/成纤维细胞共培养的方法（35）。DiFi球体在胶原蛋白I和Matrigel的3D穹顶中培养。原代人结肠成纤维细胞被添加到穹顶上方，然后浸润到球体之间的空隙中（图3B）。该方法产生了胶原蛋白I/Matrigel穹顶，其中DiFi细胞口袋周围有被成纤维细胞渗透的胶原蛋白，模拟了肿瘤的组织结构（图3C）。为了测试DDR1在共培养系统中对胶原蛋白排列的影响，我们生成了不含球体、含表达DDR1的DiFi球体或含DDR1敲除DiFi球体的穹顶。然后将原代人正常结肠成纤维细胞添加到培养物中。我们发现，含有表达DDR1的DiFi球体的DiFi/成纤维细胞3D共培养比含有DDR1敲除球体或完全不含球体的穹顶更有效地排列胶原蛋白（图3D和E）。为了确认成纤维细胞对于观察到胶原蛋白排列增加是必不可少的，我们重复了该实验，未添加成纤维细胞，发现在没有成纤维细胞的情况下，表达DDR1的DiFi球体不会促进胶原蛋白排列（补充图S5A和S5B）。为了测试DDR1在结直肠癌球体中的表达是否也会导致CD8+ T细胞排斥，在成纤维细胞添加后7天，将CellBrite红标记的CD8+ T细胞添加到共培养物中。与表达DDR1的DiFi球体相比，DDR1敲除DiFi球体中浸润的CD8+ T细胞数量显著增加（图4A和B）。然而，DDR1表达可能通过独立于成纤维细胞的机制减少了CD8+ T细胞浸润。因此，我们重复了该实验，未添加成纤维细胞，发现CD8+ T细胞同等地浸润DDR1敲除和表达DDR1的DiFi球体（补充图S5C和S5D）。此外，在没有成纤维细胞的共培养物中，CD8+ T细胞的有效侵入约高出10倍，这与成纤维细胞在独立于DDR1效应的CD8+ T细胞排斥中的作用一致。总体而言，这些结果表明，表达DDR1的DiFi球体和成纤维细胞能够在体外3D人结直肠癌模型中促进胶原蛋白排列和CD8+ T细胞排斥。

图4 查看大图 下载幻灯片
表达DDR1的DiFi球体与正常成纤维细胞共培养促进3D共培养中的CD8+ T细胞排斥。A–D，CD8+（A和B）和CD4+（C和D）T细胞（红色，白色箭头指向球体中标记的T细胞）的代表性DIC与表面荧光合并图像以及DiFi球体在24小时后T细胞平均浸润的海盗图。比例尺，25 μm。每个点是单个穹顶中每个DiFi球体的平均T细胞数量。ns，无统计学意义；**，P < 0.01。N = 9个穹顶。

图4 查看大图 下载幻灯片
表达DDR1的DiFi球体与正常成纤维细胞共培养促进3D共培养中的CD8+ T细胞排斥。A–D，CD8+（A和B）和CD4+（C和D）T细胞（红色，白色箭头指向球体中标记的T细胞）的代表性DIC与表面荧光合并图像以及DiFi球体在24小时后T细胞平均浸润的海盗图。比例尺，25 μm。每个点是单个穹顶中每个DiFi球体的平均T细胞数量。ns，无统计学意义；**，P < 0.01。N = 9个穹顶。

图4关闭。由于对人结直肠癌样本的多重免疫荧光（MxIF）分析揭示了DDR1表达与CD8+但不与CD4+ T细胞浸润肿瘤上皮之间的相关性，我们想知道CD4+ T细胞是否在3D共培养系统中同样有效地浸润对照和DDR1敲除DiFi球体。因此，我们重复了T细胞浸润实验，这次使用CD4+ T细胞。与结直肠癌患者样本的分析一致，我们发现DiFi细胞的DDR1表达不影响CD4+ T细胞浸润，无论成纤维细胞是否存在（图4C和D；补充图S5E和S5F）。这些结果表明，DDR1介导的T细胞排斥效应专属于CD8+ T细胞。

DDR1 cECD从结直肠癌细胞中释放到supermeres中

我们接下来确定DDR1 cECD是否由DiFi细胞释放以及cECD是否足以增加胶原蛋白排列。使用针对DDR1 ECD的抗体对细胞裂解液和条件培养基进行免疫印迹，发现DDR1 cECD仅存在于条件培养基中（图5A）。能够检测全长DDR1和DDR1 cECD的ELISA显示，胶原蛋白I处理后条件培养基中的DDR1水平增加（图5B）。

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胶原蛋白I诱导的DDR1激活促进含DDR1 cECD的supermeres从DiFi结直肠癌细胞中释放。A，DiFi全细胞裂解液（WCL）和条件培养基（CM）的免疫印迹。DiFi CM中的蛋白质通过添加10%三氯乙酸沉淀。免疫印迹使用胞内结构域（ICD；Cell Signaling Technology, 5583；左）和ECD（R&D, AF2396；右）抗体探测。图代表两个单独的印迹。B，2D中胶原蛋白I（50 μg/mL）处理24小时后的DiFi细胞CM中DDR1的ELISA。每个数据点是三次独立实验中三倍重复的一次测量。柱高为测量平均值±SEM。****，P < 0.0001。C，使用DDR1 ECD抗体（R&D, AF2396）对DiFi细胞分泌分级的免疫印迹。D，三个重复的DiFi细胞在3D生物反应器中培养的EV沉淀物、exomeres和supermeres的映射DDR1质谱计数的覆盖度和位置（见"材料与方法"）。标出了对应于DDR1 ECD、跨膜结构域（TMD）和ICD的区域。E，超离心分级DiFi细胞CM中DDR1的代表性水平，通过ELISA测量。实验进行三倍重复。数值代表平均测量值±SEM。****，P < 0.0001。F，3D生物反应器中培养的DiFi细胞分泌的DDR1总量在EVs（0.6%）、exomeres（2.7%）、supermeres（66.2%）和游离蛋白（30.5%）中的相对含量，通过ELISA测量。代表性实验进行三倍重复。

图5 查看大图 下载幻灯片
胶原蛋白I诱导的DDR1激活促进含DDR1 cECD的supermeres从DiFi结直肠癌细胞中释放。A，DiFi全细胞裂解液（WCL）和条件培养基（CM）的免疫印迹。DiFi CM中的蛋白质通过添加10%三氯乙酸沉淀。免疫印迹使用胞内结构域（ICD；Cell Signaling Technology, 5583；左）和ECD（R&D, AF2396；右）抗体探测。图代表两个单独的印迹。B，2D中胶原蛋白I（50 μg/mL）处理24小时后的DiFi细胞CM中DDR1的ELISA。每个数据点是三次独立实验中三倍重复的一次测量。柱高为测量平均值±SEM。****，P < 0.0001。C，使用DDR1 ECD抗体（R&D, AF2396）对DiFi细胞分泌分级的免疫印迹。D，三个重复的DiFi细胞在3D生物反应器中培养的EV沉淀物、exomeres和supermeres的映射DDR1质谱计数的覆盖度和位置（见"材料与方法"）。标出了对应于DDR1 ECD、跨膜结构域（TMD）和ICD的区域。E，超离心分级DiFi细胞CM中DDR1的代表性水平，通过ELISA测量。实验进行三倍重复。数值代表平均测量值±SEM。****，P < 0.0001。F，3D生物反应器中培养的DiFi细胞分泌的DDR1总量在EVs（0.6%）、exomeres（2.7%）、supermeres（66.2%）和游离蛋白（30.5%）中的相对含量，通过ELISA测量。代表性实验进行三倍重复。

图5关闭。我们此前发现，当含AREG的EVs呈现给细胞时，EGFR配体amphiregulin（AREG）的生长促进活性与等量重组蛋白相比显著增强（42）。因此，我们研究了DDR1 cECD是以游离蛋白形式还是分泌型纳米颗粒（如EVs、exomeres（43）或supermeres（26, 34））形式释放的，以及包装成纳米颗粒是否是诱导胶原蛋白排列所必需的。DiFi细胞条件培养基通过FPLC-SEC分级为EVs、exomeres和supermeres（见"材料与方法"）。使用该方法分离的DiFi细胞分级物在之前的出版物中进行了广泛表征和验证（34）。通过ELISA评估每个分泌分级物中的DDR1 cECD水平，发现大部分DDR1存在于supermeres中（图5E和F）。为了确保ELISA能够检测DDR1 cECD和全长蛋白，对条件培养基和各个分级物进行的免疫印迹显示，在条件培养基和supermeres中存在与DDR1 cECD预期质量对应的条带（图5C）。为了进一步确认DDR1 cECD存在于supermeres中，我们分析了此前发表的DiFi EVs沉淀物、exomeres和supermeres的蛋白质组学数据（34），发现DDR1计数仅映射到supermeres中的DDR1 ECD（图5D）。

含DDR1 cECD的supermeres处理的成纤维细胞比DDR1敲除supermere处理组的收缩性更强

CASTA揭示了上皮DDR1表达与附近基质中与成纤维细胞收缩相关的基因之间的空间相关性（图2E–H；补充图S3A和S3B）。此外，我们此前表明结直肠癌来源的supermeres能够在结直肠癌系细胞之间进行信号传递（26）。这些发现使我们假设含DDR1 cECD的supermeres促进了成纤维细胞收缩，从而导致胶原蛋白排列。因此，我们用DDR1敲除的supermeres和含DDR1 cECD的supermeres处理了来自三名患者（补充表S2）和两种成纤维细胞系（HNPCC和HCF）的原代正常成纤维细胞，在3D胶原蛋白I/Matrigel穹顶中培养并测量穹顶直径随时间的变化。对于所有成纤维细胞，含DDR1 cECD的supermeres比DDR1敲除DiFi supermeres促进了更大的收缩（图6A和B）。如前所述，我们此前发现AREG包装成分泌型纳米颗粒会影响其信号活性。因此，我们想知道游离DDR1 ECD是否足以促进成纤维细胞收缩，还是必须与supermere关联。为了比较supermere关联的DDR1 cECD和游离DDR1 ECD的效果，我们用溶剂或重组DDR1 ECD处理3D成纤维细胞培养物。结果在不同患者样本间存在差异，表明只有含DDR1 cECD的supermeres才能一致地促进收缩（补充图S7A和S7B）。

图6 查看大图 下载幻灯片
含DDR1 cECD的supermeres促进正常成纤维细胞的收缩。A，含HNPCC（左）和HCF（右）细胞系的胶原蛋白I/Matrigel穹顶直径，分别用表达DDR1的DiFi细胞（圆圈）或DDR1敲除的DiFi细胞（三角形）衍生的supermeres处理。数据点代表平均直径±SEM。*，P < 0.05；**，P < 0.01。N = 5–9个穹顶。B，含从手术切除的结直肠癌（患者6和8）和腺瘤（患者7）邻近正常区域分离的原代成纤维细胞的胶原蛋白I/Matrigel穹顶直径，分别用表达DDR1或DDR1敲除的DiFi细胞衍生的supermeres处理。直径归一化至第一个时间点。数据点代表平均直径±SEM。*，P < 0.05；**，P < 0.01。N = 6–8个穹顶。患者数据见补充表S2。

图6 查看大图 下载幻灯片
含DDR1 cECD的supermeres促进正常成纤维细胞的收缩。A，含HNPCC（左）和HCF（右）细胞系的胶原蛋白I/Matrigel穹顶直径，分别用表达DDR1的DiFi细胞（圆圈）或DDR1敲除的DiFi细胞（三角形）衍生的supermeres处理。

数据点代表平均直径 ± 标准误。*，P < 0.05；**，P < 0.01。N = 5–9个穹顶。B，含有从外科切除的结直肠癌相邻正常区域分离的原代成纤维细胞（患者6和8）和腺瘤（患者7）的胶原蛋白I/Matrigel穹顶，用含有DDR1表达或DDR1 KO DiFi细胞衍生的超微粒体（supermeres）处理。直径以第一个时间点归一化。数据点代表平均直径 ± 标准误。*，P < 0.05；**，P < 0.01。N = 6–8个穹顶。患者数据见补充表S2。关闭图6。接下来，我们旨在确定将重组DDR1 ECD重新引入DDR1 KO DiFi衍生的超微粒体是否足以促进收缩。将重组DDR1 ECD与DDR1 KO DiFi衍生的超微粒体预混后，加入到HNPCC和HCF细胞系以及患者6的原代成纤维细胞中。将混合的重组DDR1 ECD和DDR1 KO DiFi衍生的超微粒体加入到HCF和患者6成纤维细胞中，与DDR1 KO DiFi衍生的超微粒体处理的对照组相比，并未促进收缩。在HNPCC成纤维细胞中，引入重组DDR1 ECD导致收缩性略有降低（补充图S8）。这些结果表明，先前实验中含DDR1 cECD的DiFi超微粒体诱导成纤维细胞收缩并不是由于DDR1 ECD与DiFi超微粒体的简单组合所致。先前有研究提出DDR1 cECD-胶原蛋白结合对于引起排列是必需的（22）。为了测试超微粒体相关的DDR1 cECD-胶原蛋白结合对于诱导成纤维细胞收缩是否必需，我们使用了PRTH101，一种能够阻断DDR1 cECD-胶原蛋白结合的单克隆抗体（23）。将含有DDR1 cECD的超微粒体与PRTH101或同型对照抗体预孵育，然后用于处理HCF和HNPCC成纤维细胞的3D培养物。与超微粒体相关的DDR1 cECD-胶原蛋白结合对于诱导收缩并非必需这一模型一致，两种成纤维细胞系在经PRTH101预孵育的超微粒体处理后均未表现出收缩性降低（补充图S9）。为了调查成纤维细胞收缩是否与胶原蛋白排列相关，我们将患者8的成纤维细胞加入到缺乏DiFi球体的3D胶原蛋白I/Matrigel穹顶中，并添加溶剂、含有DDR1 cECD的超微粒体、DDR1 KO DiFi超微粒体或重组DDR1 ECD，然后测量胶原蛋白排列。出乎意料的是，在这个没有DiFi细胞存在的实验初始版本中，未观察到胶原蛋白排列的变化，表明需要结直肠癌细胞的存在才能观察到超微粒体的效应（补充图S7C和S7D）。因此，我们向患者8原代成纤维细胞与DDR1 KO DiFi球体的3D胶原蛋白I/Matrigel共培养体系中添加溶剂、含有DDR1 cECD的超微粒体、DDR1 KO超微粒体或重组DDR1 ECD。正如预期，我们发现用重组DDR1 ECD处理导致排列程度显著高于溶剂组，而用DDR1 KO超微粒体处理与含DDR1 cECD超微粒体处理相比，胶原蛋白排列呈现轻微下降趋势（补充图S7E和S7F）。结果与同一成纤维细胞样本的收缩结果一致（图6B；补充图S7B）。因此，用含DDR1 cECD的超微粒体处理成纤维细胞引起的收缩多于用DDR1 KO超微粒体处理，且增加的收缩与胶原蛋白排列增加相关。讨论

本研究的目标是分析DDR1 cECD对MSS结直肠癌中胶原蛋白排列和CD8+ T细胞排斥的影响。根据结果，我们提出了一个模型，即DDR1 cECD从MSS结直肠癌细胞释放到基质中，以超微粒体形式包装，从而促进成纤维细胞的收缩，导致胶原蛋白排列和CD8+ T细胞排斥（图7）。图7。大图 下载幻灯片 DDR1 cECD结直肠癌衍生的超微粒体对胶原蛋白排列和CD8+ T细胞排斥效应的模型。在DDR1低表达结直肠癌中，胶原蛋白无序，CD8+ T细胞能够进入肿瘤上皮（左）。在DDR1高表达结直肠癌中，胶原蛋白与DDR1结合导致ECD裂解，将其以超微粒体形式释放到基质中。含有DDR1 cECD的超微粒体促进成纤维细胞收缩性，导致胶原蛋白排列，从而阻碍CD8+ T细胞进入肿瘤上皮（右）。[在BioRender中创建。Hamilton, M. (2026) https://BioRender.com/xw4jnrb.] 图7。大图 下载幻灯片 DDR1 cECD结直肠癌衍生的超微粒体对胶原蛋白排列和CD8+ T细胞排斥效应的模型。在DDR1低表达结直肠癌中，胶原蛋白无序，CD8+ T细胞能够进入肿瘤上皮（左）。在DDR1高表达结直肠癌中，胶原蛋白与DDR1结合导致ECD裂解，将其以超微粒体形式释放到基质中。含有DDR1 cECD的超微粒体促进成纤维细胞收缩性，导致胶原蛋白排列，从而阻碍CD8+ T细胞进入肿瘤上皮（右）。[在BioRender中创建。Hamilton, M. (2026) https://BioRender.com/xw4jnrb.] 关闭图7。我们发现DDR1 cECD与结直肠癌超微粒体相关，这是一种我们最近发现的无膜纳米颗粒，富含生物标志物（26, 34）。我们此前已在超微粒体中鉴定出DDR1的cECD（34）。这项工作扩展了超微粒体的作用，描述了超微粒体在结直肠癌CD8+ T细胞排斥中的新功能性作用。虽然存在与超微粒体无关的游离DDR1 cECD库（图5C和F），但大多数用纯化的重组DDR1 ECD处理成纤维细胞的实验并未导致成纤维细胞收缩，这突显了含DDR1 cECD的超微粒体在成纤维细胞动力学中的重要性。我们提出结直肠癌来源的超微粒体对基质成纤维细胞产生作用，而DDR1 cECD的存在调节其效应以增加成纤维细胞收缩。该模型进一步指出了超微粒体在细胞收缩调控中的作用，这在癌症和发育中有广泛的意义（44）。未来的工作应该区分DDR1 RTK信号传导与DDR1 cECD的效应。我们发现，在含DDR1表达的DiFi球体存在的情况下，正常成纤维细胞促进了胶原蛋白排列。关键的是，DDR1表达对胶原蛋白排列和CD8+ T细胞排斥的效应仅在包含成纤维细胞的共培养中观察到，表明收缩性细胞是必需的。综上所述，这些结果表明DDR1表达的DiFi细胞和成纤维细胞足以在结直肠癌3D共培养模型中诱导胶原蛋白排列。先前提出的DDR1 cECD介导的免疫排斥模型依赖于DDR1与胶原蛋白结合以促进其排列（22）。在此，我们完善了DDR1介导的胶原蛋白排列机制。我们发现当缺少成纤维细胞时DDR1不促进胶原蛋白排列，且超微粒体与PRTH101预孵育并不降低其诱导胶原蛋白排列的作用，这支持了这样一个模型：超微粒体相关的DDR1 cECD通过其对基质成纤维细胞的影响来促进胶原蛋白排列，而非通过胶原蛋白结合。CASTA代表了一种分析基因表达与胶原蛋白排列关系的新方法。尽管其他研究已描述了与胶原蛋白排列相关的外基质成分变化（45），但CASTA能够鉴定与胶原蛋白排列相关的细胞类型和通路。CASTA是一种强大的工具，可用于表征其他情况下与胶原蛋白排列相关的基因表达，例如其他癌症类型、纤维化以及涉及胶原蛋白组织的发育过程，如软骨、肌肉和肌腱。我们使用CASTA鉴定了与胶原蛋白排列和DDR1表达相关的基因，这些基因富集于成纤维细胞表达的参与收缩及相关过程的基因，如细胞-基质粘附和运动，与现有的收缩介导的胶原蛋白排列模型一致（46）。重要的是，通过对多个样本进行CASTA分析，我们发现与DDR1表达和胶原蛋白排列相关的基因高度多样化。尽管只有一个子集的基因在多个样本中发现与胶原蛋白排列相关，但我们发现样本倾向于共享收缩相关的基因本体。此外，用超微粒体处理不同的成纤维细胞样本，DDR1对收缩效应的规模和时序各异。这些发现表明对含DDR1 cECD超微粒体的反应是多样的，但主要导致细胞收缩性增加，从而引起胶原蛋白排列。ICB（免疫检查点阻断）已彻底改变了癌症治疗。然而，与化疗相比，尽管ICB疗效更高、毒性更低，但很少有结直肠癌患者能够从中受益。我们的结果支持DDR1作为可控靶点，以使其在MSS结直肠癌治疗中能够应用ICB，并为特定的DDR1靶向疗法可能成功或失败的原因提供了有价值的见解。与我们提出的DDR1 cECD而非其激酶域促进免疫排斥的模型一致，靶向DDR1激酶活性的小分子未能在抗癌药物开发中取得成功（47）。此外，已开发出中和DDR1 cECD的单克隆抗体，这些抗体在小鼠模型中能够提高ICB的疗效（22, 23, 48）。此处的结果表明，DDR1与胶原蛋白的结合对于其促进免疫排斥并非必需。因此，需要进一步研究如何最好地抑制含DDR1 cECD的超微粒体对成纤维细胞的效应。我们的研究证明DDR1免疫反应性与MSS肿瘤上皮中CD8+ T细胞浸润减少相关，这与DDR1在结直肠癌CD8+ T细胞排斥中的作用一致。然而，CD4+ T细胞浸润在蛋白质水平上与DDR1不相关。支持这一发现的是，DDR1表达对DiFi球体与成纤维细胞3D共培养中CD4+ T细胞浸润无影响。CD8+和CD4+ T细胞排斥差异的一个可能原因是它们对交联胶原蛋白密集网络中LAIR1介导的耗竭敏感性不同，这在肺癌模型中已有所探索（49）。尽管在MSS TMA样本中DDR1免疫反应性与CD8+ T细胞浸润之间存在强烈的负相关，但我们发现并非所有DDR1低表达的肿瘤在肿瘤实质内都有高水平的CD8+ T细胞浸润。因此，在某些肿瘤中，DDR1可能对瘤内CD8+ T细胞排斥并非必需。这表明某些MSS结直肠癌患者可能对ICB有反应（50）。这些结果还表明某些MSS肿瘤采用DDR1非依赖机制来排斥CD8+ T细胞。在尝试将DDR1 cECD靶向疗法与ICB联合用于MSS结直肠癌患者治疗之前，需要确立预测性标志物，以识别最可能应答的患者。尽管MSI-H结直肠癌中的突变数量多于MSS结直肠癌，但低突变负荷的癌症也可能具有增加的 neoantigen（新抗原）呈递（6, 7）。例如，目前正在研究靶向低突变癌症中的隐性新抗原（6, 7）。此外，我们最近发现，在MSI-H结直肠癌癌前病变中，CD8+ T细胞浸润增加先于超突变发生（5）。因此，在MSS结直肠癌中靶向DDR1与隐性新抗原靶向免疫疗法联合可能特别有效。综上所述，这些结果强调了DDR1作为MSS结直肠癌治疗靶点的价值，同时也强调了鉴定生物标志物的必要性，以将患者分层为可能对DDR1靶向疗法有反应的患者。

数据可用性

转录组数据在基因表达综合数据库（Gene Expression Omnibus）中公开可得（RRID: SCR_005012; GSE311294）。本研究产生的其他数据可在文章、补充文件或向通讯作者索取。

代码可用性

本项目使用的代码可在GitHub上获取（https://github.com/maxwellh-bit/CASTA）。

作者利益声明

J.L. Franklin报告了一项待批的美国专利US2025/0123297A1。其他作者未报告任何利益声明。

作者贡献

M.S. Hamilton：概念构思、数据整理、软件、正式分析、验证、调查、可视化、方法学、撰写初稿、撰写-审阅与编辑。S.T. Ellis：数据整理、软件、正式分析、验证、可视化、方法学。Z. Cao：资源、验证。O.S. Tutanov：资源。A.J. Simmons：资源。R. Aramandla：资源。J.N. Higginbotham：资源。M. Ramirez：正式分析。K.W. Schnee：软件、正式分析。M.E. Bechard：资源。H. Kaur：正式分析。J.L. Franklin：概念构思、撰写初稿、撰写-审阅与编辑。S. Mandal：资源。K.S. Lau：资源、监督。Q. Liu：正式分析、监督。J.A. Goettel：资源。A. Pozzi：概念构思、监督、经费获取、撰写-审阅与编辑。R.J. Coffey：概念构思、资源、监督、经费获取、撰写初稿、撰写-审阅与编辑。

致谢

我们感谢Sarah E. Glass博士编辑手稿。我们感谢Tegy Vadakkan在通过2HG开发全切片胶原蛋白成像方面的支持。我们还感谢Mary Kay Washington博士帮助CASTA样本的获取和选择，感谢Frank Revetta为CASTA制备切片。下一代测序由范德堡VANTAGE核心完成。

无标记胶原蛋白成像通过2HG技术在范德堡细胞成像共享资源核心设施完成。MxIF和H&E切片扫描由范德堡数字组织学共享资源核心设施完成（P30DK058404）。本研究部分由R01DK119212和退伍军人事务部卓越评审1I01BX002025资助A. Pozzi，以及P50CA236733、R35CA197570和P30CA068485资助R.J. Coffey。我们感谢获得VUMC核心奖学金（用于流式细胞术）和VUMC消化疾病研究中心资助（P30DK058404）。A. Pozzi是退伍军人事务部高级研究职业科学家奖的获得者（IK6BX005240）。作者感谢Nicholas Tierney纪念胃肠道癌症基金、R. Daniel Beauchamp纪念胃肠道肿瘤基金以及Robert J. Kleberg, Jr和Helen C. Kleberg基金会的大力支持。注：本文的补充数据可在《癌症研究通讯》在线版获取（https://aacrjournals.org/cancerrescommun/）。