与DDR1和胶原排列相关的基质基因

《Cancer Research Communications》：Stromal genes associated with DDR1 and collagen alignment ...

　　

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摘要

免疫检查点阻断（ICB）是治疗高微卫星不稳定性（MSI-H）结直肠癌的有效手段，这类肿瘤以CD8+ T细胞高度浸润为特征。微卫星稳定性（MSS）结直肠癌对ICB无反应，部分原因在于肿瘤内CD8+ T细胞稀少。我们最近发现圆盘状结构域受体1（DDR1）是MSS结直肠癌中与CD8+ T细胞排斥相关的四个基因之一。关于DDR1裂解胞外域（cECD）在乳腺和胰腺癌小鼠模型中的存在和作用，现有报道存在矛盾。为探讨DDR1 cECD在人结直肠癌中的作用，我们开发了胶原排列与空间转录组学分析（CASTA），该分析揭示，参与成纤维细胞收缩性的基因既与DDR1肿瘤表达相关，也与通过无标记二次谐波生成（2HG）成像确定的肿瘤胶原排列相关。利用结直肠癌球体与成纤维细胞的三维胶原共培养体系，我们证明DDR1促进胶原排列和CD8+ T细胞排斥。我们在MSS结直肠癌超级体（supermeres）中发现大量DDR1 cECD——这些超级体是直径25至35纳米的无膜分泌型纳米颗粒。含有DDR1 cECD的超级体足以诱导人结肠成纤维细胞收缩。我们提出了一种模型：含有DDR1 cECD的超级体促进MSS结直肠癌中基质成纤维细胞的收缩，导致胶原排列和CD8+ T细胞排斥。这些结果支持DDR1 cECD作为MSS结直肠癌中的有吸引力治疗靶点。

意义：在人结直肠癌中，含有DDR1胞外域的超级体促进成纤维细胞收缩和胶原排列，从而排斥肿瘤内CD8+ T细胞。

引言

免疫检查点阻断（ICB）是结直肠癌治疗的一项重大临床进展，可实现持久缓解（1）。然而，ICB的疗效仅限于占15%的高微卫星不稳定性（MSI-H）结直肠癌患者，这类患者的特征是肿瘤内存在细胞毒性CD8+ T细胞浸润（2）。其余85%的微卫星稳定性（MSS）结直肠癌患者对ICB无反应（3）。MSI-H结直肠癌中CD8+ T细胞浸润增加通常归因于突变负荷增加，导致新抗原呈递增加（4）。该模型可被解读为，在MSS结直肠癌中使用ICB是不可行的，因为MSS结直肠癌的突变相对较少。然而，近期研究已对该假设提出质疑（4）。我们最近表明，在MSI-H结直肠癌前驱病变中，CD8+ T细胞浸润增加先于高度突变，提示高度突变对于高CD8+ T细胞浸润并非必不可少（2, 5）。此外，低突变负荷的肿瘤可呈递新抗原，例如通过转录新生开放阅读框，导致隐秘新抗原的呈递（6, 7）。因此，增加CD8+ T细胞浸润至MSS结直肠癌肿瘤的方法有望增加适合ICB治疗的患者数量。我们最近描述了一个与MSS结直肠癌中CD8+ T细胞排斥相关的四基因特征（8）。其中一个基因编码圆盘状结构域受体1（DDR1），这是一种受体酪氨酸激酶（RTK），在结合纤维性和非纤维性胶原后被激活（9, 10）。据报道，这种结合与DDR1在胞外近膜区域的蛋白水解裂解相偶联，导致裂解胞外域（cECD）释放至细胞外空间（11–13）。DDR1已被证明参与免疫调节（14–20）以及结肠纤维化（21），使其成为进一步研究的有吸引力候选靶点。在小鼠乳腺癌异种移植模型中，DDR1表达导致细胞外胶原纤维排列增加，从而排斥CD8+ T细胞（22, 23）。DDR1 cECD在该模型中足以引起排斥，表明DDR1通过非激酶依赖性、非细胞自主机制调节胶原重塑。进一步研究发现DDR1在胰腺癌中也具有促癌作用。然而，DDR1表达与胶原排列增加无关，且未检测到cECD，提示DDR1可能通过不同机制在不同癌症类型中促进癌症发展（24）。尽管DDR1在结直肠癌CD8+ T细胞排斥中的作用已被研究，但这些研究聚焦于全长DDR1，未探讨DDR1 cECD在胶原排列中的作用，且仅限于MSI-H小鼠异种移植模型（14）。因此，我们试图探讨DDR1 cECD在促进人结直肠癌CD8+ T细胞排斥中的潜在作用，重点关注其对胶原排列的影响。重组DDR1 ECD可在体外促进胶原组织化（25）。然而，DDR1 cECD如何在肿瘤环境中导致胶原排列尚不清楚。因此，本研究的重点是更好地理解DDR1 cECD如何在结直肠癌体内促进胶原排列。我们发现分泌的DDR1 cECD主要存在于MSS结直肠癌超级体中，这些超级体是我们几年前发现的直径25至35纳米的无膜分泌型纳米颗粒（26）。为调查与人结直肠癌肿瘤中胶原排列相关的基因、通路和细胞类型，我们开发了胶原排列与空间转录组学分析（CASTA）。将该方法应用于五块MSS结直肠癌肿瘤组织块后，我们发现肿瘤DDR1表达和胶原排列与基质中成纤维细胞收缩性相关基因的过度表达相关。随后，我们建立了三维结直肠癌球体/成纤维细胞/T细胞共培养体系，利用该体系证明结直肠癌细胞释放的含有DDR1 cECD的超级体促进胶原排列、成纤维细胞收缩性以及CD8+ T细胞（而非CD4+ T细胞）的排斥。我们提出了一种模型：DDR1 cECD从结直肠癌细胞中以超级体形式释放，导致成纤维细胞收缩性增加，进而引起胶原排列和CD8+ T细胞排斥。

材料与方法

细胞

DiFi细胞是Coffey实验室开发的女性MSS结直肠癌细胞系（RRID: CVCL_6895；参考文献27）。囊性克隆3（CC-3）、刺突克隆1（SC-1）和西妥昔单抗耐药囊性克隆（CC-CR）细胞系是从ATCC获得的HCA-7细胞（28, 29）中先前分离的克隆。其他结直肠癌细胞系来自ATCC。成纤维细胞系此前从一例遗传性非息肉病性结直肠癌（HNPCC）患者和一例散发性结直肠癌（HCF）患者的远端手术切除边缘分离获得（参考文献30）。细胞用于实验前进行了支原体检测。细胞系鉴定通过短串联重复序列分析完成。原代成纤维细胞从志愿者结直肠癌和腺瘤切除标本的邻近正常组织中分离获得（范德堡大学医学中心[VUMC]；机构审查委员会方案号（IRB）#151721），方法改编自Rockman等人的方法（31）。分离结肠隐窝后，组织被精细切碎，置于含有15%牛生长血清的完全培养基中（见"二维细胞培养"部分），于10厘米培养皿中培养。待成纤维细胞贴附后，移除残余组织。成纤维细胞分离在Primocin存在下进行，以防止支原体污染。每3至4天更换一次培养基。CD4+和CD8+ T细胞从ATCC购买的健康供者外周血单核细胞（货号#PCS-800-012，批号80204253）中回收。细胞在FACS缓冲液（含2% FBS和2 mmol/L乙二胺四乙酸的PBS）中用FITC标记的抗人CD3（BioLegend, 344815）、CD4（BioLegend, 317407）和CD8（BioLegend, 100733）抗体染色15分钟（4°C），经PBS洗涤，以350 × g离心5分钟，最后重悬于FACS缓冲液中。CD4+和CD8+细胞使用BD FACSMelody（BD Biosciences）分选。分选后的CD8+和CD4+ T细胞以350 × g沉淀，重悬于含有重组人IL2（Thermo Fisher Scientific）的ImmunoCult人CD3/CD28 T细胞激活剂/ImmunoCult-XF T细胞扩展培养基（STEMCELL Technologies）中。

二维细胞培养

结直肠癌细胞系和成纤维细胞在DMEM（Corning, 10-017-CV）中培养，补充10%牛生长血清（结直肠癌细胞系、HNPCC和HCF）或15%（原代成纤维细胞）牛生长血清（Cytiva, SH3054.03）、100×非必需氨基酸（Cytiva, SH30238.01）、200 μmol/L L-谷氨酰胺（Cytiva, SH30034.01）和10 U/mL青霉素-链霉素（Cytiva, SV30010）。细胞系每2至3天传代一次。原代成纤维细胞在约80%汇合时传代。实验在细胞解冻后第2至5次传代后进行。

细胞培养基分级

为从DiFi细胞制备大量无血清条件培养基进行分级，使用中空纤维生物反应器，如前所述（32）。反应器装载1至5×10^8 DiFi细胞。葡萄糖利用率为每天1至2毫克，用于确认细胞已达到平衡生长阶段。收集培养基并按前法处理（32, 33）。为去除细胞碎片，每次收集后，20毫升条件培养基以250 × g离心，然后以2,500 × g离心10分钟，并通过MilliporeSigma Millex 0.22微米孔径注射器过滤器重力过滤。每份混匀物分为60毫升等份，分级前于4°C储存。培养基通过超速离心分级为细胞外囊泡（EV）沉淀、外泌体（exomeres）和超级体（supermeres），以便定量不同分级中的DDR1，方法如前所述（34）。快速蛋白液相色谱-尺寸排阻色谱（FPLC-SEC）用于制备用于处理实验的超级体，方法如前所述（34）。我们此前已证明，通过超速离心或FPLC-SEC分离的超级体含有相似水平的DDR1 cECD（34）。

DiFi细胞中DDR1基因敲除

为在DiFi细胞中敲除DDR1，从MilliporeSigma购买含嘌呤霉素抗性、GFP、Cas9和DDR1敲除（KO）及非靶向对照单导向RNA（sgRNA）序列的慢病毒（人DDR1 KO sgRNA序列：GTAAACGCAAGCCGGTAGCTC）。转导时，将25微升病毒加入15毫升含5% FBS并补充1.2 μg/mL聚凝胺的培养基中，用于处理亲本DiFi细胞。静置5天后，DiFi细胞以递增浓度嘌呤霉素处理。使用BD Biosciences Aria III根据GFP表达进行FACS分选，以获得DDR1 KO和DDR1表达对照克隆。通过免疫印迹和通过分解分析插入-缺失序列（TIDE）测定，在克隆中验证DDR1敲除成功。

TIDE测定

为在基因组水平验证DDR1敲除，使用Qiagen DNeasy Blood & Tissue试剂盒（69506）从DDR1表达对照和DDR1 KO DiFi克隆中分离基因组DNA。通过PCR扩增CRISPR靶点周围序列（引物序列：GCTCCTGGGACCTCTACTTC和CAGGGGAGGAGCAGGTTTAG）。使用Qiagen PCR纯化试剂盒（28104）分离扩增子，并使用相同引物提交GenHunter进行Sanger测序。每个克隆进行三次测序运行。将序列色谱图上传至https://tide.nki.nl/以定量DDR1 KO效率和KO等位基因混合物。

CellTiter-Glo细胞活力测定

为测试3D培养中DiFi细胞的活力，将500个DiFi细胞悬浮于白色壁96孔板（Greiner Bio-One, 655098）中的5微升I型胶原/Matrigel圆顶中（见"三维结直肠癌球体/成纤维细胞共培养"部分）。测量时，向每孔加入100微升CellTiter-Glo试剂（Promega, G7572）。摇动10分钟，使用Synergy H1读板仪读取发光值。进行三次生物学重复，每次包含八次技术重复。

三维结直肠癌球体/成纤维细胞共培养

球体/成纤维细胞共培养方法基于Strating等人此前描述的方法（35），并作以下修改。DiFi细胞用胰蛋白酶消化，用18号针头抽吸5次，使用Bio-Rad TC20自动细胞计数仪计数。细胞重悬于20% Matrigel（Corning, 354234）、1.25 mg/mL I型胶原（Corning, 354249）、5×中和缓冲液[0.1 mol/L 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸和2% NaHCO3溶于MEM α培养基（Gibco, 12561-056）]和无血清培养基（见"二维细胞培养"方法）的混合物中。三维培养凝胶组成通过测试一系列I型胶原和Matrigel浓度进行优化。所用凝胶组成允许成纤维细胞最佳贴附于圆顶表面和凝胶收缩。含有2,000个DiFi细胞的35微升凝胶圆顶接种于24孔玻璃底板（MatTek, P24G-0-13-F）。预实验发现，初始胶原结构对聚合温度极为敏感，此前已有相关报道（36）。

当穹顶在铺板后随即被转移至培养箱时，最早铺板的穹顶展现出与最后铺板的穹顶截然不同的胶原排列方式。为了纠正这一问题，穹顶在室温下聚合1小时后再加入室温培养基并转移至细胞培养箱。DiFi细胞生长13天，直至形成球体。在向用于量化胶原排列的共培养体系中添加成纤维细胞之前，成纤维细胞先以1:200的CellBrite红色染料（Biotium，30023）在37°C悬液中染色20分钟，随后洗涤并计数。在比较DDR1表达对照细胞和DDR1敲除DiFi细胞的实验中，每孔直接加入12,000个成纤维细胞。在添加超微小囊泡的实验中，先将超微小囊泡以0.2 mg/mL稀释于培养基中，并用0.22 μm注射器滤膜进行无菌过滤。将稀释后的超微小囊泡用于重悬成纤维细胞后再添加至球体。添加成纤维细胞后，共培养体系培养6天后进行二次谐波生成（2HG）成像。在T细胞侵袭实验中，在添加成纤维细胞后7天将穹顶转移至含有新鲜培养基的新培养板中，以减少培养基中积累的因子对侵袭的影响。CD4+或CD8+ T细胞按照"细胞"部分所述进行分选，并在穹顶转移至新孔后立即加入。在不含成纤维细胞的实验中，球体培养20天。在不含DiFi细胞的实验中，成纤维细胞在穹顶聚合1小时后直接加入。收缩实验

为测量成纤维细胞的收缩性，将300个成纤维细胞悬浮于5 μL胶原I/Matrigel穹顶中，铺板于96孔低黏附培养板（Falcon，351172）上，在室温下放置1小时，然后加入室温培养基。每穹顶的成纤维细胞数量经过选择，使其在未接受超微小囊泡处理的情况下产生中等程度的收缩。通过将HNPCC细胞系分别暴露于0至0.2 mg/mL不同浓度超微小囊泡的范围来确定最佳超微小囊泡浓度（补充图S6）。由于0.2 mg/mL浓度产生了最大效果，所有实验均选用该浓度。PRTH101由Incendia Therapeutics开发，随后进行合成。在超微小囊泡与PRTH101或同型对照抗体（Bio X Cell，BE0297）预孵育的实验中，先将超微小囊泡稀释至0.2 mg/mL并以无菌过滤处理，然后加入10 μg/mL抗体。超微小囊泡-抗体混合物在37°C摇床上孵育1小时后再加入成纤维细胞培养体系。为确保穹顶对培养板的黏附不会抑制收缩，使用移液器枪头轻轻将穹顶从培养板上脱离。铺板后使用MuviCyte每3小时成像一次，持续36小时。在ImageJ（RRID：SCR_003070）中测量穹顶直径。在第一时间点形状不规则或位置导致无法测量直径的穹顶被排除在分析之外。由于直径测量的客观性质，进行分析的人员对实验条件未设盲。每个条件使用N = 3至10个技术重复。对于生物学重复，使用两种成纤维细胞系（HNPCC和HCF）以及三种患者来源的原代成纤维细胞（患者6–8；患者信息见补充表S2）。原代成纤维细胞的选择确保了两种性别均被涵盖。三维培养中胶原的2HG成像

为对三维培养中的胶原进行成像，凝胶先用4%多聚甲醛（PFA）PBS固定10分钟，随后用PBS洗涤2次。穹顶从培养板上取下，使用氰基丙烯酸酯基粘合剂固定在10 cm培养皿底部，并浸没于PBS中。使用Nikon AX多光子显微镜以880 nm激发、25×浸水物镜收集图像。信号在4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）通道440 nm处收集。Z轴堆叠由600至650个截面组成，从穹顶表面开始，间隔为0.3 μm。每个穹顶收集4幅图像。使用ImageJ的OrientationJ插件（RRID：SCR_014796）量化胶原的一致性（coherence）。量化所有Z切片上的平均排列度，以捕获侵袭性T细胞在特定距离内将遭遇的全部胶原排列程度。每个条件使用三个生物学重复，每个重复含三个技术重复。由于图像分析完全自动化，进行分析的人员对实验条件未设盲。T细胞侵袭实验

在添加T细胞之前，含和不含成纤维细胞的DiFi球体按照"三维结直肠癌球体/成纤维细胞共培养"部分所述进行三维培养。培养开始20天后添加T细胞。CD8+和CD4+ T细胞以1:200的CellBrite红色染料（Biotium，30023）在37°C悬液中染色20分钟，随后洗涤并计数。穹顶转移至含有新鲜培养基的新的24孔板中。每孔加入50,000个CD8+或CD4+ T细胞。24小时后，穹顶转移至新培养板并用PBS洗涤以去除未侵袭入穹顶的细胞。穹顶用4% PFA PBS固定10分钟，随后用PBS洗涤2次。为量化T细胞侵袭，穹顶通过落射荧光和微分干涉差（DIC）进行观察，由未设盲的人员手动计数每个DiFi球体内CellBrite阳性细胞的数量。为确保仅计入成功穿透周围胶原进入穹顶的T细胞，分析仅限于完全位于穹顶内的球体。每个条件下使用三个生物学重复，每个重复含三个技术重复。人福尔马林固定石蜡包埋样本

由71例MSS结直肠癌患者肿瘤中1 mm核心组成的福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织芯片（TMA）以及用于CASTA分析的5例原发性人FFPE结直肠癌样本及其伴随的病理报告，通过合作人体组织网络（CHTN；IRB #101531；见补充表S1和S2）获得。样本使用符合VUMC伦理审查委员会的规定。性别和年龄作为生物学变量

基于胶原排列具有年龄和性别特异性（37）的报告，为结直肠癌TMA、CASTA分析以及正常成纤维细胞的分离选择了覆盖不同年龄段及两种性别的患者样本（患者数据见补充表S1和S2）。用于CASTA的样本选择仅限于经组织病理学确定基质比例较高的MSS肿瘤。该数据集允许鉴定与DDR1表达和胶原排列相关的基因。然而，仅使用5个样本无法从这些数据中得出人群水平的结论。多重免疫荧光

使用GE Cell Dive按照前述方法（5）对结直肠癌TMA进行循环染色。所用抗体包括：泛细胞角蛋白Alexa Fluor 488直接偶联抗体（Santa Cruz Biotechnology，53-9003-82）、CD8 Alexa Fluor 647直接偶联抗体（BioLegend，13983）和CD4 Alexa Fluor 647直接偶联抗体（Abcam，ab133616）。为标记DDR1，D1G6单克隆抗体（mAb；Cell Signaling Technology，5583）由Cell Signaling Technology直接偶联至Alexa Fluor 555。通过使用ilastik在PanCK通道上进行训练生成的上皮掩膜，从322个位点中分离出图像中的上皮区域。DDR1免疫反应性以ImageJ（RRID：SCR_003070）中的平均荧光强度进行量化。CD8+和CD4+ T细胞由对DDR1表达设盲的人员手动计数。肿瘤被分为DDR1低表达和高表达组，分别代表上皮DDR1免疫反应性的下半区和上半区。DDR1低表达和高表达肿瘤中CD8+和CD4+ T细胞浸润差异的统计学显著性通过Wilcox检验（适用于非参数数据）确定。Student t检验用于参数数据。免疫印迹

为评估DDR1水平，细胞在约80%汇合度时使用Cell Signaling Technology裂解缓冲液（9803）进行裂解，在台式离心机中以13,000 RPM离心6分钟，然后在4°C下超声处理20秒。加入上样缓冲液后，样品在9% SDS-PAGE凝胶上分离，转至硝酸纤维素膜上，并按照前述方法（18）使用1:1,000的Cell Signaling Technology DDR1 D1G6 mAb（靶向DDR1 C端；5583）进行探测。在某些实验中，血清饥饿的DiFi细胞用溶剂（20 mmol/L醋酸）或50 μg/mL的I型胶原（溶解于20 mmol/L醋酸中；Corning，354249）处理。24小时后，通过免疫印迹使用1:1,000的Cell Signaling Technology抗DDR1 pY513抗体（14531S）分析细胞裂解物中磷酸化DDR1的水平。抗β-actin 1:2,000作为上样对照（Sigma-Aldrich，A5318）。为检测条件培养基中的DDR1 cECD，向条件培养基中加入10%三氯乙酸，在冰上处理30分钟以沉淀蛋白质。样品以10,000 × g离心10分钟收集沉淀，用冷丙酮洗涤2次后用裂解缓冲液重悬，并加载至SDS-PAGE凝胶中。为检测分泌组分中的DDR1 cECD，在加入SDS-PAGE上样缓冲液前不对样品进行额外预处理。为检测DDR1 cECD，印迹用Odyssey Intercept（TBS）封闭缓冲液（927-60001）封闭，并使用1:1,000的R&D抗DDR1 N端抗体（AF2396）探测。作为上样对照，进行Ponceau S染色（Sigma-Aldrich，P7170）。所有印迹均使用1:5,000的LI-COR Odyssey二抗进行探测，并使用Odyssey XF成像仪成像。酶联免疫吸附测定

为通过酶联免疫吸附测定（ELISA）量化条件培养基和分泌组分中的DDR1 cECD，按照制造商说明使用人DDR1 SimpleStep ELISA试剂盒（abcam，ab260063）。DiFi条件培养基在添加前稀释1:64。为确定分泌组分中DDR1的相对含量，通过离心在100 kDa离心滤器（MilliporeSigma，UFC71008）中对DiFi条件培养基进行浓缩，并按照前述方法进行超速离心分级。为完全覆盖条件培养基中所有DDR1，浓缩步骤的流穿液和超微小囊泡上清液也被收集并通过ELISA分析。各分组的蛋白质浓度和体积被测量，并用于计算各分组中细胞外DDR1占分泌蛋白总量的百分比。为获得线性范围内的结果，分别加入0.122 mg的EVs、0.234 mg的exomeres和0.125 μg的超微小囊泡。流穿液和超微小囊泡上清液稀释1:2。每个ELISA测量进行三个技术重复。CASTA

从5个人FFPE结直肠癌肿瘤块上用微切片机切割一张初始30 μm切片，随后进行连续5 μm切片。5 μm切片由CytAssist转移至空间转录组学玻片（10x Genomics，100466）上，并按照标准Visium v2方案进行处理，提供约50 μm的分辨率。RNA测序使用NovaSeq X系列双端读法进行，每个样本目标读取量为1.25亿条。Reads使用Space Ranger比对，标志定位使用Loupe Browser进行。为对胶原进行成像，30 μm切片经脱蜡、复水后，用由50%甘油和50% PBS组成的封片剂封片。切片通过Nikon AX MP以880 nm激发、25×物镜进行2HG成像。Z切片间隔为7 μm，图像在切片上平铺采集。所得图像进行拼接和Z轴投影。为确定每个区域的排列度，使用自制宏程序改造了OrientationJ ImageJ插件，以量化图像各区域的一致性。由于胶原排列的尺度大于所需排列热力图的分辨率，该宏程序根据图像周围200 μm范围内的像素将一致性值分配给各像素。热力图与Visium数据通过利用napari Python插件（RRID：SCR_022765）的自制流程进行配准。为将Visium位点细分为上皮和基质，使用R中的Seurat包（RRID：SCR_007322）从各样本的位点中生成统一流形近似与投影（UMAP）降维聚类。聚类根据其与大体染色（H&E）图像的叠加情况被分为上皮、基质或模糊类别。

用于比较间质中基因表达和胶原排列与相邻上皮中DDR1表达的分析时，使用了紧邻上皮斑点的间质斑点子集。为了确定与相邻上皮中排列和DDR1表达相关的基因，使用Python中的SciPy包（RRID: SCR_008058）为每个基因计算了Spearman ρ和Bonferroni校正P值。绘图与统计学

所有图表均在R中使用ggplot2包（RRID: SCR_014601）制作。趋势线代表线性回归模型。统计学分析使用rstatix（RRID: SCR_021240）和ggpubr（RRID: SCR_021139）包进行。对于两组样本的比较，参数数据采用Student t检验，非参数数据采用Wilcoxon检验。当比较多组样本时，使用ANOVA，随后在与所有样本比较时使用Tukey事后检验，在与对照组比较时使用Dunnett检验。P < 0.05被认为具有显著性。结果

MSS结直肠癌中DDR1表达与CD8+ T细胞浸润减少相关

我们此前报道了MSS结直肠癌中DDR1基因表达与CD8A基因表达降低相关（8）。由于DDR1蛋白丰度在翻译后水平受调控（13, 38, 39），DDR1 mRNA和蛋白水平可能不完全相关。因此，我们使用CD8和DDR1抗体进行免疫荧光（IF）染色，评估71例人MSS结直肠癌样本在结直肠癌TMA中DDR1免疫染色和CD8+ T细胞向肿瘤的浸润情况。与之前的报道一致，DDR1免疫反应性主要局限于上皮（图1A；参考文献40、41）。CD8+ T细胞向肿瘤上皮的浸润是有效ICB的前提条件。因此，分析需要区分上皮内和间质中的CD8+ T细胞。因此，我们对IF染色的TMA样本进行了上皮和间质分割，仅分析上皮区域，因为大部分DDR1在上皮中表达。图1. 查看大图 下载幻灯片 MSS结直肠癌中高DDR1免疫反应性与CD8+ T细胞浸润减少相关。A，来自MSS结直肠癌TMA的三个1-mm肿瘤芯片的DDR1、CD8、PanCK和DAPI免疫荧光代表性图像，根据上皮DDR1荧光强度分为DDR1低表达和高表达组。上皮区域以白色虚线标示。上皮内CD8+ T细胞以白色箭头标示。标尺，200 μm。B和C，DDR1低表达和高表达MSS肿瘤样本中每个上皮区域内CD8+（B）和CD4+（C）T细胞相对数量的Pirate图。每个点代表1个肿瘤的平均值。N = 58例DDR1低表达和13例DDR1高表达患者。ns，无统计学差异；*，P < 0.05。图1. 查看大图 下载幻灯片 MSS结直肠癌中高DDR1免疫反应性与CD8+ T细胞浸润减少相关。A，来自MSS结直肠癌TMA的三个1-mm肿瘤芯片的DDR1、CD8、PanCK和DAPI免疫荧光代表性图像，根据上皮DDR1荧光强度分为DDR1低表达和高表达组。上皮区域以白色虚线标示。上皮内CD8+ T细胞以白色箭头标示。标尺，200 μm。B和C，DDR1低表达和高表达MSS肿瘤样本中每个上皮区域内CD8+（B）和CD4+（C）T细胞相对数量的Pirate图。每个点代表1个肿瘤的平均值。N = 58例DDR1低表达和13例DDR1高表达患者。ns，无统计学差异；*，P < 0.05。关闭图1。DDR1低表达MSS肿瘤中每个上皮区域的CD8+ T细胞数量显著高于DDR1高表达MSS肿瘤（图1A和B；补充图S1）。重要的是，T细胞浸润与DDR1的关系仅限于CD8+ T细胞，因为DDR1低表达和高表达MSS结直肠癌样本中CD4+ T细胞计数无变化（图1C；补充图S1）。鉴定与人结直肠癌样本中胶原排列和上皮DDR1表达相关的基因

在确立了MSS结直肠癌中DDR1表达与瘤内CD8+ T细胞浸润之间的反向关系后，我们接着旨在确定可能参与DDR1介导的胶原排列的基因、通路和细胞类型。由于DDR1被发现能促进胶原排列并进而损害CD8+ T细胞向肿瘤的浸润（22），我们试图确定结直肠癌中上皮DDR1表达是否与间质胶原排列增加相关。为此，我们开发了CASTA方法，用于研究人结直肠癌样本中DDR1与胶原排列之间的关系，能够捕获胶原排列与基因表达之间的空间关系（图2A）。该方法将五个人FFPE MSS结直肠癌肿瘤蜡块（这五名患者的临床特征见补充表S1）切成连续切片，第一张切片为30 μm，后续切片为5 μm。第一张切片通过2HG成像（图2B）。根据每个区域测量的胶原一致性生成胶原排列的空间图谱（图2C）。相邻的连续切片进行标准Visium v2空间转录组学处理，然后与胶原排列数据合并（图2A）。由此生成的数据集整合了肿瘤中基因表达和胶原排列的空间分辨信息。图2. 查看大图 下载幻灯片 结直肠癌中与DDR1和胶原排列相关的间质基因。A，CASTA示意图。B，1号患者肿瘤样本的全切片2HG代表性图像。标尺，1 mm（左）和400 μm（插图）。C，1号患者肿瘤样本的胶原一致性热图。D，间质和上皮斑点中胶原一致性的Pirate图。每个点为一个Visium斑点。****，P < 0.0001。E，每个基因与间质胶原一致性及相邻上皮中DDR1表达的关联。正向相关且校正P < 0.05的基因以蓝色突出显示。F，E中鉴定基因的基因本体术语。收缩相关本体以粗体显示。G，两个或更多样本中与DDR1表达相关的间质基因的重叠。H，两个或更多样本中与DDR1相关的间质基因的基因本体术语。收缩相关本体以粗体显示。患者数据见补充表S1。图2. 查看大图 下载幻灯片 结直肠癌中与DDR1和胶原排列相关的间质基因。A，CASTA示意图。B，1号患者肿瘤样本的全切片2HG代表性图像。标尺，1 mm（左）和400 μm（插图）。C，1号患者肿瘤样本的胶原一致性热图。D，间质和上皮斑点中胶原一致性的Pirate图。每个点为一个Visium斑点。****，P < 0.0001。E，每个基因与间质胶原一致性及相邻上皮中DDR1表达的关联。正向相关且校正P < 0.05的基因以蓝色突出显示。F，E中鉴定基因的基因本体术语。收缩相关本体以粗体显示。G，两个或更多样本中与DDR1表达相关的间质基因的重叠。H，两个或更多样本中与DDR1相关的间质基因的基因本体术语。收缩相关本体以粗体显示。患者数据见补充表S1。关闭图2。在Sun等人（22）描述的乳腺癌小鼠模型中，间质中排列整齐的胶原形成屏障包围肿瘤上皮，阻碍了CD8+ T细胞的进入。与该组的发现一致，比较间质和上皮斑点中的胶原排列显示，排列整齐的胶原确实主要存在于周围间质而非肿瘤上皮本身（图2D）。鉴于DDR1 cECD是从DDR1表达的肿瘤细胞脱落，我们推测如果DDR1 cECD引起胶原排列，那么排列程度在靠近DDR1表达上皮的区域最高。确定DDR1表达与胶原排列之间关联的一个挑战在于如何将空间分离的上皮DDR1表达与间质胶原排列进行关联。为了克服这一挑战，分析仅限于紧邻肿瘤上皮的间质斑点，DDR1水平量化为最近上皮斑点中DDR1的表达量（补充图S2A）。我们首先使用这种分析确认了上皮斑点中的DDR1表达与相邻间质斑点中胶原排列增加相关，通过汇集所有五名患者的斑点（补充图S2B）。我们接着在所有样本的间质区域生成了一份与相邻上皮中DDR1及胶原排列正相关的基因列表（图2E）。鉴定的基因富集于成纤维细胞表达的基因以及与细胞收缩和细胞骨架组织相关的基因，如平滑肌α2肌动蛋白和波形蛋白（图2E和F）。我们还生成了一份与DDR1表达和胶原排列相关的上皮基因列表（补充图S3C）。虽然鉴定了一些基因，但未发现具有统计学显著性的基因本体，表明DDR1表达、胶原排列与收缩相关基因表达之间的关联特异于间质。虽然汇集所有五个样本揭示了群体中与DDR1表达和胶原排列相关的基因，但个别样本中某基因的强相关性而其他样本无相关性可能会混淆分析。例如，我们发现只有1号和2号患者的样本中存在胶原排列与血小板激活基因本体之间的关联（补充图S3A）。因此，我们对每个样本单独重复了该分析（补充图S3A和S3B）。我们鉴定了样本间共享的重叠相关基因和基因本体（图2G和H；补充图S3A和S3B）。然而，并非所有样本都共享与DDR1表达或胶原排列相关的基因本体。这主要是因为某些样本中与DDR1表达和胶原排列相关的总基因数较少，以及所鉴定本体的变化。虽然五个样本不足以得出关于基因与DDR1表达和胶原排列关联的广泛结论，但与细胞收缩相关的本体在大多数样本中都很常见（补充图S3A和S3B）。为了确定与DDR1表达和胶原排列相关的最常见本体，我们将分析集中在共享的本体上。至少两个样本之间重叠的DDR1相关基因的基因本体富集于与细胞-基质黏附、细胞收缩调节和运动性相关的基因（图2H）。总之，CASTA能够捕获每个样本中与胶原排列和DDR1表达相关的多样基因程序。这些结果表明，与胶原排列和DDR1表达相关的基因表达变化主要由成纤维细胞表达的参与收缩、运动及相关过程的基因组成。DiFi球体/成纤维细胞共培养中DDR1敲除导致胶原排列减少和CD8+ T细胞浸润降低

基于CASTA数据中DDR1表达和胶原排列与成纤维细胞收缩相关的发现，我们建立了一个共培养系统，在该系统中可以测量人结直肠癌细胞表达的DDR1对成纤维细胞在胶原排列和T细胞浸润方面的影响。我们通过免疫印迹评估了人结直肠癌细胞系的DDR1表达（图3A；补充图S4A），选择DiFi细胞用于我们的共培养系统，因为它们表达DDR1，是MSS结直肠癌细胞系，且具有明确的分泌组特征（26, 34）。为了确定DDR1在DiFi细胞中是否具有功能，我们用胶原I处理这些细胞并观察到DDR1自磷酸化（补充图S4B）。图3. 查看大图 下载幻灯片 将表达DDR1的DiFi球体与初代正常人源成纤维细胞共培养在3D共培养中促进胶原排列。A，结直肠癌细胞系中DDR1的免疫印迹。B，DiFi球体/成纤维细胞共培养方法示意图。C，DiFi球体（黄色，虚线青色轮廓）和成纤维细胞（洋红色）共培养的代表性表面对比荧光图像。标尺，200 μm。D和E，含成纤维细胞和表达DDR1或DDR1敲除DiFi球体的胶原/Matrigel穹顶中2HG图像的z轴投影和胶原一致性的Pirate图。白色箭头指向排列整齐的胶原区域。白色S表示DiFi球体。标尺，100 μm。每个点代表单个穹顶的平均一致性。ns，无统计学差异；**，P < 0.01。N = 9个穹顶。图3. 查看大图 下载幻灯片 将表达DDR1的DiFi球体与初代正常人源成纤维细胞共培养在3D共培养中促进胶原排列。A，结直肠癌细胞系中DDR1的免疫印迹。B，DiFi球体/成纤维细胞共培养方法示意图。

C, DiFi 类器官球体（黄色，虚线青色轮廓）与成纤维细胞（洋红色）共培养的代表性表面对比染色图像。比例尺，200 μm。D 和 E，含有成纤维细胞以及 DDR1 表达型或 DDR1 敲除型 DiFi 类器官球体的胶原/Matrigel 圆顶中 2HG 图像的代表性 Z 轴投影，以及胶原取向性海盗图。白色箭头指向胶原排列区域。白色 S 表示 DiFi 类器官球体。比例尺，100 μm。每个数据点代表单个圆顶的平均取向性。ns，无统计学显著性；**，P < 0.01。N = 9 个圆顶。关闭图 3。

我们接下来通过 CRISPR-Cas9 生成了 DDR1 敲除的 DiFi 细胞。通过免疫印迹和 TIDE 检测验证了 DDR1 的消除（补充图 S4C 和 S4D）。由于细胞生长速率可能是干扰变量，我们测量了在胶原 I 和 Matrigel 混合物中培养的 DDR1 敲除型和非靶向对照 DiFi 克隆的细胞活力（见"材料与方法"）。我们确定了 DDR1 敲除的 DiFi 克隆 B，其生长速率与 DDR1 表达型克隆相似（补充图 S4E），随后用于后续实验。

为了在体外模型中测量 DDR1 对胶原排列和 CD8+ T 细胞浸润的影响，我们采用了一种最初用于类器官/成纤维细胞共培养的方法（35）。DiFi 类器官球体在胶原 I 和 Matrigel 的 3D 圆顶中培养。原代患者来源的结肠成纤维细胞被添加在圆顶上方，随后它们浸润到类器官球体之间的空隙中（图 3B）。该方法产生了含有 DiFi 细胞口袋的胶原 I/Matrigel 圆顶，周围是被成纤维细胞渗透的胶原，模拟了肿瘤的组织结构（图 3C）。

为测试 DDR1 对共培养系统中胶原排列的影响，我们生成了不含类器官球体、含 DDR1 表达型 DiFi 类器官球体或含 DDR1 敲除型 DiFi 类器官球体的圆顶。然后将原代正常人结肠成纤维细胞添加到培养物中。我们发现，含有 DDR1 表达型 DiFi 类器官球体的 DiFi/成纤维细胞 3D 共培养物比含有 DDR1 敲除型类器官球体或完全不含类器官球体的圆顶更能有效地排列胶原（图 3D 和 E）。

为确认成纤维细胞对于观察胶原排列增加是必不可少的，我们在不添加成纤维细胞的情况下重复了实验，发现缺少成纤维细胞时，DDR1 表达型 DiFi 类器官球体未能促进胶原排列（补充图 S5A 和 S5B）。

为测试 DDR1 在结直肠癌类器官球体中的表达是否也会导致 CD8+ T 细胞排斥，在添加成纤维细胞 7 天后向共培养物中添加了 CellBrite 红色标记的 CD8+ T 细胞。与 DDR1 表达型 DiFi 类器官球体相比，DDR1 敲除型 DiFi 类器官球体中浸润的 CD8+ T 细胞数量显著升高（图 4A 和 B）。然而，DDR1 表达可能通过成纤维细胞非依赖性机制导致 CD8+ T 细胞浸润减少。因此我们在不添加成纤维细胞的情况下重复了实验，发现 CD8+ T 细胞同等地浸润 DDR1 敲除型和 DDR1 表达型 DiFi 类器官球体（补充图 S5C 和 S5D）。此外，在不含有成纤维细胞的共培养物中，CD8+ T 细胞的侵入效果大约提高了 10 倍，这与成纤维细胞在 CD8+ T 细胞排斥中的作用一致，该作用独立于 DDR1 的影响。总体而言，这些结果表明，DDR1 表达型 DiFi 类器官球体和成纤维细胞能够在体外 3D 人结直肠癌模型中促进胶原排列和 CD8+ T 细胞排斥。

图 4. 放大查看 下载幻灯片 DDR1 表达型 DiFi 类器官球体与正常成纤维细胞共培养促进 3D 共培养中的 CD8+ T 细胞排斥。A–D，CD8+（A 和 B）和 CD4+（C 和 D）T 细胞（红色，白色箭头指向类器官球体中标记的 T 细胞）的代表性 DIC 和表面对比染色合并图像，以及 24 小时后 DiFi 类器官球体中 T 细胞平均浸润程度的海盗图。比例尺，25 μm。每个数据点是单个圆顶中每个 DiFi 类器官球体的平均 T 细胞数。ns，无统计学显著性；**，P < 0.01。N = 9 个圆顶。

图 4. 放大查看 下载幻灯片 DDR1 表达型 DiFi 类器官球体与正常成纤维细胞共培养促进 3D 共培养中的 CD8+ T 细胞排斥。A–D，CD8+（A 和 B）和 CD4+（C 和 D）T 细胞（红色，白色箭头指向类器官球体中标记的 T 细胞）的代表性 DIC 和表面对比染色合并图像，以及 24 小时后 DiFi 类器官球体中 T 细胞平均浸润程度的海盗图。比例尺，25 μm。每个数据点是单个圆顶中每个 DiFi 类器官球体的平均 T 细胞数。ns，无统计学显著性；**，P < 0.01。N = 9 个圆顶。关闭图 4。

由于对人结直肠癌样本的多重免疫荧光（MxIF）分析显示 DDR1 表达与 CD8+ 但不是 CD4+ T 细胞向肿瘤上皮浸润之间存在相关性，我们想知道 CD4+ T 细胞是否同样有效地浸润对照和 DDR1 敲除型 DiFi 类器官球体。因此我们重复了 T 细胞浸润实验，这次使用了 CD4+ T 细胞。与结直肠癌患者样本的分析结果一致，我们发现无论有无成纤维细胞存在，DiFi 细胞的 DDR1 表达均不影响 CD4+ T 细胞浸润（图 4C 和 D；补充图 S5E 和 S5F）。这些结果表明，DDR1 介导的 T 细胞排斥效应特异性地作用于 CD8+ T 细胞。

DDR1 cECD 以超级泌体的形式从结癌细胞中释放

我们接下来确定了 DDR1 cECD 是否由 DiFi 细胞释放，以及 cECD 是否足以增加胶原排列。使用针对 DDR1 ECD 的抗体对细胞裂解液和条件培养基进行免疫印迹，结果显示 DDR1 cECD 仅存在于条件培养基中（图 5A）。能够检测全长 DDR1 和 DDR1 cECD 的 ELISA 显示，经胶原 I 处理后条件培养基中的 DDR1 水平升高（图 5B）。

图 5. 放大查看 下载幻灯片 胶原 I 诱导的 DDR1 激活促进含有 DDR1 cECD 的超级泌体从 DiFi 结癌细胞中释放。A，DiFi 全细胞裂解液（WCL）和条件培养基（CM）的免疫印迹。DiFi CM 中的蛋白通过添加 10% 三氯乙酸进行沉淀。免疫印迹使用细胞内结构域（ICD；Cell Signaling Technology, 5583；左）和胞外结构域（ECD；R&D, AF2396；右）抗体进行探测。该图代表两个独立的印迹。B，对 DiFi 细胞在 2D 中经胶原 I（50 μg/mL）处理 24 小时后的条件培养基中 DDR1 的 ELISA 检测。每个数据点是三次独立实验中三次重复的一次测量值。柱高为测量平均值 ± SEM。****，P < 0.0001。C，DiFi 细胞分泌组分用 DDR1 ECD 抗体（R&D, AF2396）的免疫印迹。D，从三个重复的 EV 沉淀物、外泌体和超级泌体中测得的 DDR1 质谱计数的覆盖范围和定位，这些来自在 3D 生物反应器中培养的 DiFi 细胞（见"材料与方法"）。标示了对应于 DDR1 ECD、跨膜结构域（TMD）和 ICD 的区域。E，ELISA 测定的超离心分级 DiFi 细胞 CM 中 DDR1 的代表性水平。实验重复三次进行。数值代表测量均值 ± SEM。****，P < 0.0001。F，ELISA 测定的在 3D 生物反应器中培养的 DiFi 细胞中 EV（0.6%）、外泌体（2.7%）、超级泌体（66.2%）和游离蛋白（30.5%）中总分泌 DDR1 的相对含量。代表性实验重复三次进行。

图 5. 放大查看 下载幻灯片 胶原 I 诱导的 DDR1 激活促进含有 DDR1 cECD 的超级泌体从 DiFi 结癌细胞中释放。A，DiFi 全细胞裂解液（WCL）和条件培养基（CM）的免疫印迹。DiFi CM 中的蛋白通过添加 10% 三氯乙酸进行沉淀。免疫印迹使用细胞内结构域（ICD；Cell Signaling Technology, 5583；左）和胞外结构域（ECD；R&D, AF2396；右）抗体进行探测。该图代表两个独立的印迹。B，对 DiFi 细胞在 2D 中经胶原 I（50 μg/mL）处理 24 小时后的条件培养基中 DDR1 的 ELISA 检测。每个数据点是三次独立实验中三次重复的一次测量值。柱高为测量平均值 ± SEM。****，P < 0.0001。C，DiFi 细胞分泌组分用 DDR1 ECD 抗体（R&D, AF2396）的免疫印迹。D，从三个重复的 EV 沉淀物、外泌体和超级泌体中测得的 DDR1 质谱计数的覆盖范围和定位，这些来自在 3D 生物反应器中培养的 DiFi 细胞（见"材料与方法"）。标示了对应于 DDR1 ECD、跨膜结构域（TMD）和 ICD 的区域。E，ELISA 测定的超离心分级 DiFi 细胞 CM 中 DDR1 的代表性水平。实验重复三次进行。数值代表测量均值 ± SEM。****，P < 0.0001。F，ELISA 测定的在 3D 生物反应器中培养的 DiFi 细胞中 EV（0.6%）、外泌体（2.7%）、超级泌体（66.2%）和游离蛋白（30.5%）中总分泌 DDR1 的相对含量。代表性实验重复三次进行。关闭图 5。

我们之前发现，EGFR 配体双调因子（AREG）的促生长活性在 AREG 含量的 EV 被呈递给细胞时比等量的重组蛋白显著增强（42）。因此，我们研究了 DDR1 cECD 是以游离蛋白形式还是分泌型纳米颗粒（如 EV、外泌体（43）或超级泌体（26, 34））形式释放的，以及包装成纳米颗粒是否为诱导胶原排列所必需。DiFi 细胞条件培养基通过 FPLC-SEC 分级为 EV、外泌体和超级泌体（见"材料与方法"）。使用该方法从 DiFi 细胞中分离的组分在之前的出版物中得到了广泛的表征和验证（34）。通过 ELISA 评估每个分泌组分中的 DDR1 cECD 水平，结果显示大部分 DDR1 存在于超级泌体中（图 5E 和 F）。为确保 ELISA 能够检测 DDR1 cECD 和全长蛋白，对条件培养基和各个组分进行的免疫印迹显示，条件培养基和超级泌体中存在与 DDR1 cECD 预期分子量对应的条带（图 5C）。为进一步确认 DDR1 cECD 存在于超级泌体中，我们分析了之前发表的 DiFi EV 沉淀物、外泌体和超级泌体的蛋白质组学数据（34），发现 DDR1 计数仅映射到超级泌体中的 DDR1 ECD（图 5D）。

含有 DDR1 cECD 的超级泌体处理的成纤维细胞比 DDR1 敲除型超级泌体处理的成纤维细胞更具收缩性

CASTA 揭示了上皮 DDR1 表达与附近基质中与成纤维细胞收缩相关的基因之间存在空间相关性（图 2E–H；补充图 S3A 和 S3B）。此外，我们之前已经证明结直肠癌来源的超级泌体能够在结直肠癌细胞系之间传递信号（26）。这些发现使我们假设，含有 DDR1 cECD 的超级泌体促进了成纤维细胞收缩，从而导致了胶原排列。因此，我们用含有 DDR1 cECD 的 DDR1 敲除型超级泌体和超级泌体在 3D 胶原 I/Matrigel 圆顶中处理了来自三位患者（补充表 S2）的原代正常成纤维细胞和两种成纤维细胞系（HNPCC 和 HCF），并测量了圆顶直径随时间的变化。对于所有成纤维细胞，含有 DDR1 cECD 的超级泌体与 DDR1 敲除型 DiFi 超级泌体相比，促进了更大的收缩（图 6A 和 B）。如上文所述，我们之前发现 AREG 包装成分泌型纳米颗粒会影响其信号转导效力。因此，我们想知道游离 DDR1 ECD 是否足以促进成纤维细胞收缩，还是必须与超级泌体结合。为比较超级泌体结合的 DDR1 cECD 和游离 DDR1 ECD 的效果，我们用车辆或重组 DDR1 ECD 处理了 3D 成纤维细胞培养物。结果在不同患者样本之间有所差异，表明只有含有 DDR1 cECD 的超级泌体才能一致地促进收缩（补充图 S7A 和 S7B）。

图 6. 放大查看 下载幻灯片 含有 DDR1 cECD 的超级泌体促进正常成纤维细胞的收缩。A，含有 HNPCC（左）和 HCF（右）细胞系的胶原 I/Matrigel 圆顶直径，经来自 DDR1 表达型（圆形）或 DDR1 敲除型（三角形）DiFi 细胞的超级泌体处理。数据点代表平均直径 ± SEM。*，P < 0.05；**，P < 0.01。N = 5–9 个圆顶。B，来自手术切除的结直肠癌（患者 6 和 8）和腺瘤（患者 7）邻近正常区域的原代成纤维细胞的胶原 I/Matrigel 圆顶直径，经来自 DDR1 表达型或 DDR1 敲除型 DiFi 细胞的超级泌体处理。直径以第一个时间点为基准归一化。数据点代表平均直径 ± SEM。*，P < 0.05；**，P < 0.01。N = 6–8 个圆顶。患者数据见补充表 S2。

图 6. 放大查看 下载幻灯片 含有 DDR1 cECD 的超级泌体促进正常成纤维细胞的收缩。A，含有 HNPCC（左）和 HCF（右）细胞系的胶原 I/Matrigel 圆顶直径，经来自 DDR1 表达型（圆形）或 DDR1 敲除型（三角形）DiFi 细胞的超级泌体处理。

数据点表示平均直径 ± 标准误。*，P < 0.05；**，P < 0.01。N = 5–9个穹顶。B. 含有从手术切除的结直肠癌（患者6和8）及腺瘤（患者7）邻近正常区域分离出的原代成纤维细胞的I型胶原/Matrigel穹顶的直径，这些穹顶用来源于DDR1表达或DDR1敲除DiFi细胞的超微粒进行处理。直径以第一个时间点归一化。数据点表示平均直径 ± 标准误。*，P < 0.05；**，P < 0.01。N = 6–8个穹顶。患者数据见补充表S2。关闭图6。接下来，我们旨在确定将重组DDR1胞外结构域（ECD）重新引入DDR1敲除DiFi来源的超微粒是否足以促进收缩。将重组DDR1 ECD与DDR1敲除DiFi来源的超微粒预混后，加入HNPCC和HCF细胞系以及患者6的原代成纤维细胞中。与DDR1敲除DiFi来源超微粒处理的对照组相比，将混合重组DDR1 ECD与DDR1敲除DiFi来源超微粒加入HCF和患者6成纤维细胞中并未促进收缩。在HNPCC成纤维细胞中，引入重组DDR1 ECD导致收缩能力略有降低（补充图S8）。这些结果表明，先前实验中含DDR1 cECD的DiFi超微粒诱导成纤维细胞收缩并非由DDR1 ECD与DiFi超微粒的简单组合所致。此前已有研究提出，DDR1 cECD与胶原的结合对于引起胶原排列是必需的（22）。为了测试超微粒相关的DDR1 cECD与胶原结合是否是诱导成纤维细胞收缩能力所必需的，我们使用了PRTH101，这是一种能够阻断DDR1 cECD与胶原结合的单克隆抗体（mAb）（23）。将含DDR1 cECD的超微粒与PRTH101或同型对照预孵育后，用于处理HCF和HNPCC成纤维细胞的三维培养体系。与超微粒相关的DDR1 cECD与胶原结合对于诱导收缩能力并非不可或缺的模型一致，当用与PRTH101预孵育的超微粒处理时，两种成纤维细胞系均未表现出收缩能力下降（补充图S9）。为了研究成纤维细胞收缩能力是否与胶原排列相关，我们将患者8的成纤维细胞加入缺乏DiFi球体的三维I型胶原/Matrigel穹顶中，并添加溶媒、含DDR1 cECD的超微粒、DDR1敲除DiFi超微粒或重组DDR1 ECD，然后测量胶原排列情况。令人惊讶的是，在这个没有DiFi细胞存在的初始版本实验中，没有观察到胶原排列的变化，提示需要结直肠癌细胞的存在才能观察到超微粒的效果（补充图S7C和S7D）。因此，我们将溶媒、含DDR1 cECD的超微粒、DDR1敲除超微粒或重组DDR1 ECD加入由患者8的原代成纤维细胞和DDR1敲除DiFi球体组成的三维I型胶原/Matrigel共培养体系中。如预期所示，我们发现重组DDR1 ECD处理导致的胶原排列显著高于溶媒组，而与含DDR1 cECD的超微粒处理相比，DDR1敲除超微粒处理导致胶原排列呈适度下降趋势（补充图S7E和S7F）。结果与同一成纤维细胞样本的收缩结果一致（图6B；补充图S7B）。因此，含DDR1 cECD的超微粒处理成纤维细胞引起的收缩程度大于DDR1敲除超微粒处理，且收缩增加与胶原排列增加相关。讨论。本研究旨在分析DDR1 cECD在微卫星稳定型（MSS）结直肠癌中对胶原排列和CD8+ T细胞排斥的影响。基于结果，我们提出一个模型，即DDR1 cECD从MSS结直肠癌细胞释放到基质中，被包装在超微粒中，促进成纤维细胞收缩，从而导致胶原排列和CD8+ T细胞排斥（图7）。图7. 结直肠癌来源的含DDR1 cECD的超微粒对胶原排列和CD8+ T细胞排斥影响的模型。在DDR1低表达结直肠癌中，胶原排列无序，CD8+ T细胞能够进入肿瘤上皮（左侧）。在DDR1高表达结直肠癌中，胶原与DDR1结合导致胞外结构域（ECD）切割，将其释放到基质中的超微粒中。含DDR1 cECD的超微粒促进成纤维细胞收缩能力，导致胶原排列，从而阻碍CD8+ T细胞进入肿瘤上皮（右侧）。[使用BioRender制作。Hamilton, M. (2026) https://BioRender.com/xw4jnrb.]关闭图7。我们发现DDR1 cECD与结直肠癌超微粒相关，超微粒是我们最近发现的一种富含生物标志物的无膜纳米颗粒（26，34）。我们之前已在超微粒中鉴定出DDR1的胞外结构域（cECD）（34）。本研究通过描述超微粒在结直肠癌CD8+ T细胞排斥中的新型功能作用，拓展了对超微粒角色的认识。尽管存在不关联超微粒的自由DDR1 cECD池（图5C和5F），但在大多数使用纯化的重组DDR1 ECD处理成纤维细胞的实验中，均未导致成纤维细胞收缩，凸显了含DDR1 cECD的超微粒在成纤维细胞动态中的重要性。我们提出，结直肠癌来源的超微粒对基质成纤维细胞发挥作用，而DDR1 cECD的存在调节了其效果以增加成纤维细胞收缩。该模型进一步指出了超微粒在调节细胞收缩能力中的作用，这在癌症和发育中具有重要意义（44）。未来的研究应区分DDR1受体酪氨酸激酶（RTK）信号传导的影响与DDR1 cECD的影响。我们发现，在存在DDR1表达DiFi球体的情况下，正常成纤维细胞可促进胶原排列。关键的是，DDR1表达对胶原排列和CD8+ T细胞排斥的影响仅在包含成纤维细胞的共培养体系中观察到，表明收缩细胞是必需的。综合这些结果，提示在结直肠癌三维共培养模型中，DDR1表达的DiFi细胞和成纤维细胞足以诱导胶原排列。此前提出的DDR1 cECD介导的免疫排斥模型依赖于DDR1与胶原结合以促进胶原排列（22）。在此，我们细化了DDR1介导的胶原排列机制。我们的发现——当没有成纤维细胞时DDR1不促进胶原排列，以及用PRTH101预孵育超微粒不会降低其对胶原排列的诱导作用——支持了一个模型，即超微粒相关的DDR1 cECD通过其对基质成纤维细胞的作用促进胶原排列，而非通过胶原结合。CASTA代表了一种分析基因表达与胶原排列关系的新方法。尽管其他人已经表征了与胶原排列相关的细胞外基质组成变化（45），但CASTA能够识别与胶原排列相关的细胞类型和通路。CASTA是一个强有力的工具，可用于表征其他情境下与胶原排列相关的基因表达，例如其他癌症类型、纤维化，以及涉及胶原组织的发育过程，如软骨、肌肉和肌腱。我们使用CASTA识别了与胶原排列和DDR1表达相关的基因，这些基因富集了涉及收缩及相关过程（如细胞-基质黏附和运动）的成纤维细胞表达基因，与现有的收缩介导胶原排列模型一致（46）。重要的是，通过对多个样本进行CASTA分析，我们发现与DDR1表达和胶原排列相关的基因具有高度多样性。尽管只有部分基因在多个样本中均与胶原排列相关，但我们仍然发现样本倾向于共享收缩相关的基因本体。此外，用超微粒处理不同成纤维细胞样本导致DDR1对收缩的影响在规模和时程上存在差异。这些发现提示，对含DDR1 cECD的超微粒的反应是多样的，但主要导致细胞收缩能力增加，从而引起胶原排列。免疫检查点阻断（ICB）已经彻底改变了癌症治疗。然而，与化疗相比，仅有少数结直肠癌患者能够从ICB提高的疗效和降低的毒性中受益。我们的结果支持DDR1作为可使ICB用于治疗MSS结直肠癌的可成药靶点，并为特定DDR1靶向治疗的成败机制提供了有价值的见解。与我们提出的DDR1 cECD而非其激酶结构域促进免疫排斥的模型一致，靶向DDR1激酶活性的小分子药物并未作为抗癌药物取得成功（47）。此外，已开发出能够中和DDR1 cECD的单克隆抗体，这些抗体在小鼠模型中提高了ICB的疗效（22，23，48）。本研究结果提示，DDR1与胶原的结合并非其促进免疫排斥所必需的。因此，需要进一步研究如何最佳地抑制含DDR1 cECD的超微粒对成纤维细胞的影响。我们的研究表明，DDR1免疫反应性与MSS肿瘤上皮中CD8+ T细胞浸润减少相关，这与DDR1在结直肠癌CD8+ T细胞排斥中的作用一致。然而，CD4+ T细胞浸润在蛋白质水平上与DDR1无相关性。支持这一发现的是，DDR1表达不影响DiFi球体和成纤维细胞三维共培养中CD4+ T细胞的浸润。CD8+和CD4+ T细胞排斥差异的一个可能原因是它们对致密交联胶原网络中LAIR1介导耗竭的敏感性不同，这在肺癌模型中已被探讨（49）。尽管在MSS组织微阵列（TMA）样本中DDR1免疫反应性与CD8+ T细胞浸润之间存在强烈的负相关，但我们发现并非所有DDR1低表达肿瘤在瘤内均具有高水平的CD8+ T细胞浸润。因此，在某些肿瘤中，DDR1可能对瘤内CD8+ T细胞排斥并非不可或缺。这提示某些MSS结直肠癌患者可能对ICB有应答（50）。这些结果还提示，某些MSS肿瘤采用DDR1非依赖机制排斥CD8+ T细胞。在尝试将DDR1 cECD靶向治疗与ICB联合用于MSS结直肠癌患者以筛选最可能应答的患者之前，需要建立预测性标志物。尽管微卫星高度不稳定型（MSI-H）结直肠癌的突变数量多于MSS结直肠癌，但低突变负荷的癌症也可能具有较高的新抗原呈递（6，7）。例如，目前有正在进行的工作旨在靶向低突变癌症中的隐蔽新抗原（6，7）。此外，我们最近发现CD8+ T细胞浸润增加先于MSI-H结直肠癌癌前病变中的超突变（5）。因此，在MSS结直肠癌中靶向DDR1与隐蔽新抗原靶向免疫疗法联合使用时可能特别有效。综合这些结果，强调了DDR1作为MSS结直肠癌治疗靶点的价值，同时也强调需要鉴定生物标志物以将患者分层为可能对DDR1靶向治疗有应答的人群。数据可用性。转录组数据公开可于Gene Expression Omnibus获取（RRID: SCR_005012; GSE311294）。本研究产生的其他数据可在文章、补充文件中获取，或向通讯作者索取。代码可用性。本项目使用的代码可在GitHub上获取（https://github.com/maxwellh-bit/CASTA）。作者利益声明。J.L. Franklin报告有一项待审专利申请（US2025/0123297A1）。其他作者未报告任何利益声明。作者贡献。M.S. Hamilton：概念化、数据整理、软件、正式分析、验证、调查、可视化、方法论、撰写—初稿、撰写—审阅与编辑。S.T. Ellis：数据整理、软件、正式分析、验证、可视化、方法论。Z. Cao：资源、验证。O.S. Tutanov：资源。A.J. Simmons：资源。R. Aramandla：资源。J.N. Higginbotham：资源。M. Ramirez：正式分析。K.W. Schnee：软件、正式分析。M.E. Bechard：资源。H. Kaur：正式分析。J.L. Franklin：概念化、撰写—初稿、撰写—审阅与编辑。S. Mandal：资源。K.S. Lau：资源、监督。Q. Liu：正式分析、监督。J.A. Goettel：资源。A. Pozzi：概念化、监督、获取资金、撰写—审阅与编辑。R.J. Coffey：概念化、资源、监督、获取资金、撰写—初稿、撰写—审阅与编辑。致谢。我们感谢Sarah E. Glass博士对稿件的编辑。感谢Tegy Vadakkan对2HG全切片胶原成像开发的支特。我们还感谢Mary Kay Washington博士在CASTA样本采购和选择方面的帮助，以及Frank Revetta为CASTA准备切片。下一代测序由范德堡大学VANTAGE核心设施完成。

无标记胶原蛋白成像通过二氢古洛糖酸（2HG）在范德堡大学细胞成像共享资源核心设施完成。多重免疫荧光（MxIF）和苏木精-伊红（H&E）切片扫描由范德堡大学数字组织学共享资源核心设施完成（P30DK058404）。本工作部分得到以下项目支持：R01DK119212和美国退伍军人事务部卓越评审项目1I01BX002025（资助给A. Pozzi），以及P50CA236733、R35CA197570和P30CA068485（资助给R.J. Coffey）。我们感谢获得范德堡大学医学中心（VUMC）核心奖学金（用于流式细胞术）及VUMC消化疾病研究中心资助P30DK058404。A. Pozzi获得了美国退伍军人事务部资深研究生涯科学家奖（IK6BX005240）。作者感谢Nicholas Tierney纪念胃肠道癌症基金、R. Daniel Beauchamp纪念胃肠肿瘤基金以及Robert J. Kleberg, Jr和Helen C. Kleberg基金会的慷慨支持。注：本文的补充数据可在《癌症研究通讯》在线版获取（https://aacrjournals.org/cancerrescommun/）。