细胞色素P450单加氧酶催化异戊二烯基氧化C(sp2)–去甲基化实现联烯与炔烃官能团的生物合成

《Nature Chemical Biology》：Biosynthetic allene and alkyne formation by enzymatic prenyl demethylation

　　

联烯（allene）和炔烃（alkyne）是化学生物学和药物发现中用途广泛的功能基团。然而，自然界如何在天然产物中——尤其是联烯——通过生物合成途径安装这些基团，目前仍知之甚少。本研究中，研究人员发现联烯和炔烃可通过常见五碳异戊二烯基（prenyl group）的氧化C(sp²)–去甲基化反应酶促形成。两种分别来自penipratynolene和sinuxylamide生物合成途径的真菌细胞色素P450单加氧酶（cytochrome P450 monooxygenase）——PpnB和NseB——被证实可催化O-异戊二烯基-L-酪氨酸（O-prenyl L-tyrosine）中C(sp²)–甲基的氧化脱除，分别生成O-高联烯基-L-酪氨酸（O-homoallenyl L-tyrosine）和O-丁-2-炔基-L-酪氨酸（O-but-2-ynyl L-tyrosine）。结合密度泛函理论（DFT）计算与同位素标记底物的生化实验，研究人员提出了一种涉及选择性C–C键断裂及随后产物决定性的氢原子夺取（hydrogen atom abstraction, HAT）步骤的机制。来自penipratynolene途径的另一个P450酶PpnD则作为一种氧化异构酶（oxidative isomerase），将四碳末端联烯转化为末端炔烃。这一精巧的酶促编辑策略以安装联烯和炔烃，拓展了P450酶的催化功能谱。

**论文解读**

**研究背景与科学问题**

联烯（allene）和炔烃（alkyne）是合成化学和化学生物学中极为重要的多功能官能团。末端炔烃和张力炔烃可通过点击化学（click chemistry）中广为人知的1,3-偶极环加成反应与叠氮化物反应，而基于末端联烯的点击反应（如双膦-铜催化的苯氧基二氮杂硼烷形成，CuPDF）也已被开发。因此，将炔烃和联烯安装到小分子中已成为药物发现和化学生物学的核心策略之一。然而，目前有机合成仍是引入这些官能团的主要方法，能够在细胞条件下兼容的酶促安装途径极为稀少。已知超过150种含联烯结构的天然产物和超过2,000种含炔烃官能团的天然产物，但已被鉴定和表征的炔烃形成生物合成酶寥寥无几，而联烯形成酶更是仅有藻类紫黄素脱环氧化酶类似物VDL1一例。因此，从未被表征的生物合成途径中发现新的联烯和炔烃形成酶具有重要的科学价值。

**研究内容与意义**

研究人员受羊毛甾醇14-α-去甲基酶CYP51催化的氧化C(sp³)–去甲基化反应的启发，提出了一个类似的氧化C(sp²)–去甲基化策略：从自然界最丰富的甲基取代烯烃——五碳异戊二烯基出发，通过末端甲基的四电子氧化生成醛或偕二醇中间体，随后经氧化性同裂C–C键断裂产生四碳乙烯基自由基中间体，再经区域选择性的氢原子夺取分别形成末端联烯或内炔。研究人员从真菌Penicillium polonicum和Xylaria spp.中分别鉴定了penipratynolene（5）和sinuxylamide B（2）的生物合成基因簇，发现了三种具有全新催化功能的真菌P450酶，证实了这一生物合成策略的可行性。本论文发表于《Nature Chemical Biology》。

**主要关键技术方法**

研究人员采用的主要技术方法包括：利用构巢曲霉（Aspergillus nidulans）异源表达系统进行基因簇的活性重构与代谢产物分析；重组蛋白的体外生化活性检测；密度泛函理论（DFT）计算评估反应能量学与机理可行性；氘代同位素标记底物的合成与液相色谱–四极杆飞行时间质谱（LC–QTOF）分析以确定甲基切除和氢夺取的区域选择性；AlphaFold3结构预测与定点突变分析产物选择性的结构基础；系统发育分析与基因组挖掘策略寻找同功能P450酶。

**研究结果**

*理论计算验证机理可行性：* DFT计算以血红素结合铁为氧化剂，分别评估了Cpd I依赖途径（从Z-偕二醇起始）和Cpd 0依赖途径（从醛起始）的反应能量。结果表明，两种途径中C–C键断裂生成乙烯基自由基中间体的步骤在动力学和热力学上均为可行，甲酸的释放提供了热力学驱动力。速率决定步骤的能垒约为15.3–15.4 kcal mol^?1，与CYP51的计算值相当。产物选择性（联烯或炔烃）取决于第二个HAT步骤中乙烯基自由基相对于血红素铁中心的结合构象。

*联烯形成生物合成基因簇的鉴定：* 研究人员从P. polonicum中鉴定了ppn生物合成基因簇，其编码一个ABBA型异戊二烯基转移酶PpnA、两个P450酶PpnB和PpnD、一个芳香族L-氨基酸氨裂合酶PpnC、一个甲基转移酶PpnE、以及PpnF和PpnG。生化实验证实PpnA专一性地催化L-酪氨酸的O-异戊二烯基化生成O-异戊二烯基-L-酪氨酸（7）。

*PpnB是联烯形成细胞色素P450酶：* 在A. nidulans中共表达ppnA和ppnB，检测并分离到了O-高联烯基-L-酪氨酸（1），其¹³C NMR中sp杂化联烯碳的特征化学位移（209 ppm）确证了联烯结构。饲喂实验证实PpnB单独负责催化7的C(sp²)–去甲基化联烯形成反应。研究人员还通过共表达工程将联烯官能团引入到聚酮-非核糖体肽N-去甲基蜜勒罗内酯A（12）的骨架中，成功获得了含联烯的类似物13。

*PpnD催化联烯到炔烃的氧化异构化：* 第二个P450酶PpnD被证实可催化末端联烯底物10氧化异构化为含α-羟基炔烃的去甲基penipratynolene（14）。DFT计算表明该反应通过末端联烯氢的HAT引发，经炔丙基自由基重排后发生立体选择性的OH回弹完成异构化。

*基因组挖掘发现内炔形成P450酶：* 通过系统发育分析，研究人员在进化枝II中发现了PpnB同源蛋白NseB（来自Nemania serpens），其与PpnB氨基酸序列同一性为65%。在A. nidulans中共表达nseA、nseB和nseC，成功产生了sinuxylamide B（2）。NseB催化7生成O-丁-2-炔基-L-酪氨酸（6）作为主要产物，以及少量联烯产物1（比例约4:1），体现了其活性位点对第二个HAT步骤区域选择性的可塑性。

*机理研究：* 利用一系列氘代底物（4,4,4-[d₃]-7、5,5,5-[d₃]-7、2-[d₁]-7、1,1-[d₂]-7）的酶促实验，研究人员明确证实了顺式C4甲基被选择性切除：PpnB反应中5,5,5-[d₃]-7使产物1增重+2 Da（对应末端联烯碳上失去一个氢），NseB反应中增重+3 Da（三个氘全部保留）。合成中间体C4-羟甲基-7（17）可被两种酶转化，而C5-羟甲基类似物18则不被接受，支持反应由C4位的区域选择性羟化起始。定点突变实验表明，活性位点远端残基（V127/I126和L380/F379）的差异影响产物选择性但不完全决定，NseB的双突变体I126V/F379L使联烯/炔烃比例提高约两倍。

**讨论与结论**

本研究发现了三种独特的真菌P450酶——PpnB（去甲基化联烯合酶）、NseB（去甲基化炔烃合酶）和PpnD（氧化联烯–炔烃异构酶），它们从共同的前体异戊二烯基通过氧化C(sp²)–去甲基化生成末端联烯、内炔和末端炔烃官能团。这是首次报道能够直接从sp²杂化碳上切除甲基的去甲基酶，此类转化在合成化学中也未见先例。机理上，C3–C4键的同裂断裂产生乙烯基自由基中间体，随后的HAT区域选择性决定了产物命运：PpnB夺取末端C5-甲基的氢生成联烯，NseB夺取C2-乙烯基氢生成内炔。该机制的提出与DFT计算、同位素标记及中间体捕获实验高度吻合。产物选择性由活性位点远端残基调控的精细构象差异决定。这些酶的发现拓展了P450超家族的催化功能谱，并为开发生物催化剂以在合成化学和药物化学中安装联烯和炔烃基团奠定了基础。此外，研究人员还提出了ginamallene等含末端联烯的xenicin型去甲二萜类化合物通过类似的氧化去甲基化策略从二萜前体经一碳删除形成的生物合成假说。