在表达多巴胺D2受体的细胞中敲除N-乙基马来酰亚胺敏感因子损害纹状体发育与多巴胺能功能并诱导小鼠ADHD样行为

《Neuropsychopharmacology》：Deletion of N-ethylmaleimide-sensitive factor in dopamine D2 receptor-expressing cells impairs striatal development and dopaminergic function and induces ADHD-like behaviors in mice

　　

N-乙基马来酰亚胺敏感因子（NSF）调节膜融合，支持神经递质释放和膜蛋白转运。NSF功能障碍与神经精神疾病相关。尽管NSF与多巴胺D₂受体（D₂R）相互作用，且NSF减少在体外诱导兴奋性毒性，但其在体内D₂R表达细胞中的作用仍不清楚。本研究检测了NSF缺失对D₂R表达细胞群和小鼠行为的影响。研究人员构建了D₂R特异性NSF条件性敲除（Nsf^f/f;D₂R-Cre）小鼠。在D₂R表达细胞中定向敲除NSF降低了D₂R表达和D₂R表达细胞密度，并降低了其相关标志物前脑啡肽原（preproenkephalin，Penk）的表达。这些变化伴随早期出生后发育期间凋亡细胞死亡增加、纹状体体积减少以及纹状体多巴胺水平显著降低。多巴胺能损伤进一步表现为纹状体多巴胺转运体（dopamine transporter，DAT）表达减少以及纹状体和黑质酪氨酸羟化酶（tyrosine hydroxylase，TH）表达减少。Nsf^f/f;D₂R-Cre小鼠表现出注意力缺陷/多动障碍（attention-deficit/hyperactivity disorder，ADHD）样行为，包括多动和冲动。联合给予哌甲酯（methylphenidate）和D₂R激动剂喹吡罗（quinpirole）可缓解这两种行为，提示ADHD治疗的一种潜在补充策略。这些发现强调了NSF在维持D₂R相关纹状体神经元群体中的关键作用，并提示NSF-D₂R相互作用的破坏可能促成ADHD样表型。该研究支持Nsf^f/f;D₂R-Cre模型对ADHD的转化相关性，并表明靶向D₂R功能障碍，特别是对难治性ADHD，可能是一种有前景的治疗策略。

N-乙基马来酰亚胺敏感因子（NSF）是一种同源六聚体三磷酸腺苷酶，在膜融合、神经递质释放和膜蛋白运输中发挥关键作用。既往研究提示NSF功能障碍与神经精神疾病相关，且NSF可与多巴胺D₂受体（D₂R）直接结合并调节其膜定位。然而，NSF在体内D₂R表达细胞中的生理功能尚不清楚。D₂R在纹状体中等多棘神经元高表达，是基底节间接通路的重要组分，参与运动控制、抑制调节和奖赏处理。临床影像学研究显示，注意力缺陷/多动障碍（ADHD）患者存在纹状体D₂R/D₃R可用性降低、多巴胺转运体（DAT）表达减少及纹状体体积缩小，提示D₂R功能障碍是ADHD神经生物学的核心环节。基于此，研究人员构建了D₂R特异性NSF条件性敲除（Nsf^f/f;D₂R-Cre）小鼠，以探究NSF在D₂R表达细胞中的体内功能及其与ADHD样行为的关系。

研究人员利用Cre-loxP系统生成Nsf^f/f;D₂R-Cre小鼠，在D₂R表达细胞中特异性敲除NSF。结果显示，该小鼠纹状体D₂R表达细胞密度显著降低，伴随早期出生后凋亡增加、纹状体体积缩小和纹状体多巴胺水平大幅下降，同时表现出多动和冲动样ADHD行为。联合给予哌甲酯（MPH）和D₂R激动剂喹吡罗（QNP）可有效缓解这些行为。这些发现揭示了NSF-D₂R相互作用在维持纹状体D₂R神经元群体和多巴胺能功能中的关键作用，为ADHD的病理机制和治疗策略提供了新见解。

主要关键技术方法包括：①采用KOMP Repository打靶载体构建floxed Nsf等位基因，与D₂R-Cre转基因小鼠交配获得条件性敲除小鼠（D₂R-Cre品系B6.FVB(Cg)-Tg(Drd2-Cre)ER44Gsat/Mmucd获自MMRRC，University of California, Davis）；②用地高辛标记探针进行原位杂交检测Nsf、D₂R、D₁R、前脑啡肽原（Penk）mRNA表达；③免疫组化和免疫印迹检测D₂R、DAT、酪氨酸羟化酶（TH）蛋白表达；④qRT-PCR验证mRNA水平；⑤高效液相色谱-电化学检测（HPLC-ECD）测定纹状体多巴胺浓度；⑥行为学测试包括开场实验、悬崖回避实验、高架十字迷宫、前脉冲抑制（PPI）、三箱社交互动实验和转棒实验；⑦药理学实验腹腔注射MPH（5 mg/kg）和QNP（2 mg/kg）单用或联用，评估对运动活性和冲动样行为的影响。样本均来自日本福井大学动物研究委员会批准的动物