《Signal Transduction and Targeted Therapy》：Hepassocin prevents age-related liver senescence and facilitates liver regeneration by activating AMPK
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肝脏衰老显著损害肝功能与再生能力，增加慢性肝病相关发病率和死亡率的风险。鉴定这些过程的分子调控因子可能揭示有前景的治疗靶点。尽管Hepassocin（HPS）是一种已知具有肝脏保护功能的肝细胞因子，其对成年小鼠肝脏稳态的影响甚微，但其在长期肝脏维持中的作用仍不
肝脏衰老显著损害肝功能与再生能力，增加慢性肝病相关发病率和死亡率的风险。鉴定这些过程的分子调控因子可能揭示有前景的治疗靶点。尽管Hepassocin（HPS）是一种已知具有肝脏保护功能的肝细胞因子，其对成年小鼠肝脏稳态的影响甚微，但其在长期肝脏维持中的作用仍不清楚。在本研究中，研究人员观察到在衰老小鼠和老年人群中，循环及肝内HPS水平均降低。此外，在12月龄（老年）小鼠中，2/3部分肝切除（partial hepatectomy, PHx）后HPS的上调显著减弱。老年HPS基因敲除（knockout, KO）小鼠表现出不同程度的肝脂肪变性、加剧的细胞衰老和受损的自噬。老年HPS-KO小鼠在PHx后的肝再生严重受损，表现为死亡率增加、肝细胞增殖减少、肝脏质量恢复延迟以及自噬障碍加重。在机制上，HPS通过Annexin A2（ANXA2）-细胞外信号调节激酶2-90 kDa核糖体蛋白S6激酶1-肝激酶B1（ANXA2-ERK-p90RSK-LKB1）信号级联直接激活肝细胞中的5’-AMP活化蛋白激酶催化亚基α1（AMPK）。与野生型同窝小鼠相比，老年HPS-KO小鼠在静止期和再生期肝脏中均表现为LKB1和AMPK活化降低，以及哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mechanistic target of rapamycin kinase, mTOR）活性升高。AMPK激动剂AICAR治疗可改善老年HPS-KO小鼠的肝脏衰老表型并恢复肝再生能力。重要的是，外源性HPS给药增强了老年野生型小鼠的再生效果。这些结果确立了HPS通过AMPK依赖性机制作为对抗肝脏衰老的新型保护因子。旨在增强HPS信号传导的治疗策略可能为对抗年龄相关肝功能障碍和再生失败提供可行的方法。
**一、研究背景与科学问题**
肝脏在能量代谢、外源及内源物质解毒、分子生物合成和免疫调节中发挥核心作用。肝病每年导致约120万人死亡，占全球总死亡数的3.5%，影响近15亿人。年龄相关的肝脏结构和功能改变，包括肝体积减少、致密体形成增加、应激反应失调、生长调控基因下调和DNA修复受损，共同导致老年个体肝功能储备下降和肝病易感性增加。全球超过70%的新发肝细胞癌（hepatocellular carcinoma, HCC）病例和80%的相关死亡发生在55岁及以上人群中。老年人肝病防治已成为重要的公共卫生问题。
细胞衰老是肝脏衰老的重要特征。衰老肝细胞表现出显著降低的再生能力，这与70岁以上患者及12月龄以上小鼠肝切除术后死亡率显著升高相关。衰老肝细胞通过分泌衰老相关分泌表型（senescence-associated secretory phenotype, SASP）因子塑造组织微环境，诱导邻近细胞发生二次衰老并加剧炎症和组织损伤。然而，特异性调控年龄相关肝细胞衰老的分子机制尚不完全清楚。
Hepassocin（HPS），又称纤维蛋白原样蛋白1（fibrinogen-like protein 1, FGL1），是一种具有多重功能的肝细胞因子，包括促进肝细胞增殖、代谢调节和免疫调节。HPS在多种急性肝损伤模型中通过促进肝细胞增殖和抑制凋亡发挥保护作用。然而，HPS缺失对年轻成年小鼠肝再生的影响甚微，可能由于再生通路之间存在代偿机制。鉴于HPS在肝脏代谢和再生中的重要作用，研究人员假设HPS可能在减轻肝脏衰老和支持老年个体再生能力中发挥关键作用。
**二、研究设计与技术方法**
本研究使用CRISPR/Cas9系统生成的全身性HPS基因敲除（knockout, KO）小鼠（C57BL/6J背景），以3月龄（成年）和12月龄（老年）小鼠为研究对象，通过标准Higgins-Anderson模型进行约70%部分肝切除（partial hepatectomy, PHx）。人类血浆样本来自新疆军区总医院健康供体，按年龄分为<50岁（n=24）、50-70岁（n=34）和>70岁（n=36）三组；另分析了一个人类肝细胞癌蛋白质组学数据集中患者癌旁非肿瘤组织样本（<50岁，n=63；≥50岁，n=89）。主要技术方法包括：免疫印迹、qPCR和ELISA检测基因和蛋白表达；SA-β-gal染色和脂褐素ELISA评估细胞衰老；透射电子显微镜观察自噬囊泡；mCherry-GFP-LC3B腺病毒转染检测自噬流；12?I-HPS饱和及竞争结合实验鉴定肝细胞膜受体；pull-down联合质谱鉴定HPS相互作用蛋白；免疫共沉淀验证蛋白互作；免疫组织化学检测BrdU、PCNA阳性细胞；AICAR（AMPK激动剂）和重组HPS蛋白进行干预实验。
**三、主要研究结果**
**1. HPS缺失加剧年龄相关的肝脏衰老**
在12月龄HPS-KO小鼠中，研究人员通过ELISA检测发现肝内脂褐素积累增加，通过SA-β-gal染色发现原代肝细胞衰老相关β-半乳糖苷酶活性升高，通过免疫印迹发现p16
INK4a和p21
WAF1/Cip1蛋白水平上调，通过qPCR发现SASP相关基因mRNA表达增加。成年HPS-KO小鼠除p21
WAF1/Cip1轻度升高外无明显肝脏衰老表型，表明HPS缺失以年龄依赖性方式促进肝细胞衰老和SASP激活。
**2. HPS缺失加剧年龄诱导的肝功能障碍**
与野生型同窝小鼠相比，老年HPS-KO小鼠表现出显著的葡萄糖不耐受和胰岛素抵抗，肝脏AKT磷酸化水平降低。肝内甘油三酯、总胆固醇和游离脂肪酸水平升高，Oil Red O染色证实肝脂质积累增加。脂代谢基因分析显示，脂肪酸合成增强而脂肪酸氧化降低。机制研究揭示，HPS缺乏诱导严重的内质网应激，上调SREBP切割激活蛋白（SCAP）表达，降低胰岛素诱导基因1（INSIG1）和INSIG2蛋白水平，促进SREBP-1c的切割活化和成熟形式核转位。
**3. HPS缺乏促进衰老诱导的肝自噬抑制**
透射电子显微镜观察发现，老年HPS-KO肝细胞自噬囊泡数量增加。免疫印迹显示MAP1LC3B-I向LC3B-II转化减少，SQSTM1/p62积累增加，Atg7表达下降。氯喹（chloroquine, CQ）处理实验证实p62积累源于自噬降解受损。mCherry-GFP-LC3B实验显示HPS-KO肝细胞中自噬体积累而自溶酶体减少，证实自噬体-溶酶体融合及降解受损。自噬相关基因Atg5、Atg7、Atg12、Atg13、Ulk1和LC3b的mRNA表达均显著下调。
**4. HPS缺乏显著损害老年小鼠肝切除诱导的肝再生**
PHx后，成年WT小鼠血浆和肝内HPS水平显著升高，而老年小鼠中这一反应明显减弱。所有成年小鼠术后存活7天。老年WT小鼠PHx后72小时存活率100%，7天存活率87%；而老年HPS-KO小鼠分别降至60%和40%。老年HPS-KO小鼠肝/体重比恢复延迟，BrdU、Ki67和PCNA阳性肝细胞显著减少，Cyclin D和Cyclin A2蛋白诱导减弱。TNF-α和IL-6水平及c-fos和c-myc表达无差异，表明早期启动反应不受影响。PHx诱导的再生相关短暂脂肪变性（TRAS）在老年HPS-KO肝脏中加剧，PPARα靶基因上调减弱。PHx后36小时老年HPS-KO肝脏凋亡增加，表现为cleaved caspase-3升高和TUNEL阳性细胞增多。
**5. HPS缺乏导致老年静止期和再生期肝脏LKB1/AMPK低活化和mTOR过度活化**
AMPK Thr172磷酸化在老年HPS-KO肝脏中显著降低，下游底物ACC和eIF4E磷酸化同步下降。相反，mTOR Ser2448、ULK1 Ser757和S6K磷酸化增加。LKB1 Ser431磷酸化明显减弱，而肝内ATP水平无差异。PHx后再生肝脏中，AMPK活化在老年HPS-KO小鼠中严重受损，TFEB Ser211磷酸化增加而核转位减少，eNOS磷酸化降低。成年HPS-KO小鼠再生肝脏表现为ERK磷酸化降低而STAT3和CaMKKβ磷酸化升高，AMPK、AKT、STAT5和STAT6活化未改变，提示代偿通路激活可能维持了成年小鼠的再生能力。
**6. HPS通过ANXA2-ERK-p90RSK-LKB1通路激活肝细胞AMPK**
重组HPS蛋白以剂量和时间依赖性方式诱导原代小鼠肝细胞和人HepG2细胞中AMPK磷酸化。时间进程分析显示HPS依次激活ERK（5分钟）、p90RSK（15分钟）、LKB1（30-120分钟）和AMPK/ACC（30-120分钟）。ERK抑制剂U0126消除p90RSK、LKB1和AMPK磷酸化；p90RSK抑制剂SL0101损害LKB1和AMPK磷酸化；LKB1抑制剂radicicol而非CaMKKβ抑制剂STO-609阻断HPS诱导的AMPK磷酸化。LKB1敲低不影响ERK和p90RSK活化但显著降低AMPK和ACC磷酸化。12?I-HPS饱和结合实验证实肝细胞膜上存在特异性HPS受体，EGF和HGF均不能竞争性置换HPS结合。Pull-down联合质谱鉴定出ANXA2为候选HPS相互作用蛋白，免疫共沉淀和共定位实验确认了二者的结合。ANXA2敲低损害HPS结合并减弱HPS诱导的ERK、p90RSK、LKB1和AMPK磷酸化。
**7. AMPK再激活挽救肝细胞衰老并恢复老年肝脏再生能力**
AMPK激动剂AICAR处理老年HPS-KO小鼠7天，不改变ERK、p90RSK和LKB1磷酸化状态，但增加AMPK和ACC磷酸化并降低S6K磷酸化。伴随p16
INK4a和p21
WAF1/Cip1蛋白表达抑制、脂褐素积累减少和SASP基因表达下调。AICAR剂量依赖性增强PHx后肝细胞增殖和肝脏质量恢复，显著改善老年HPS-KO小鼠术后存活率，并逆转再生肝脏中的自噬损伤。CQ抑制自噬流后，AICAR促增殖效应部分减弱，提示自噬损伤是再生不良的重要原因。
**8. 外源性HPS增强老年小鼠肝再生**
重组HPS蛋白（1 mg/kg，每日腹腔注射，连续7天）增加老年WT肝脏中PHx诱导的ERK、p90RSK、LKB1、AMPK和ACC磷酸化。1 mg/kg和2 mg/kg两种剂量均剂量依赖性增加PHx后36小时肝细胞增殖（BrdU和PCNA阳性细胞）并改善36和72小时肝脏质量恢复。HPS治疗剂量依赖性提高老年HPS-KO小鼠PHx后7天存活率，降低肝脂褐素积累，抑制p16
INK4a和p21
WAF1/Cip1蛋白水平并下调SASP基因表达，同时恢复PHx后36小时肝脏自噬。
**四、讨论与结论**
本研究证实HPS在对抗年龄相关肝功能障碍和再生受损中发挥关键作用。HPS缺乏加速肝脏衰老，表现为细胞衰老增加、代谢紊乱、自噬受损和再生能力下降。循环和肝内HPS水平随年龄下降，提示HPS减少可能促进自然肝衰老和修复功能受损。在机制层面，HPS通过ANXA2-ERK-p90RSK-LKB1信号轴激活AMPK，对维持老年肝脏在稳态和再生条件下的代谢和自噬稳态至关重要。成年HPS-KO小鼠表现正常，与CaMKKβ和STAT3代偿性活化相关。
AMPK作为中枢营养感应系统，激活后可减少氧化应激、增强自噬、抑制炎症和调节代谢。HPS缺乏导致AMPK低活化，引起ACC磷酸化降低、脂肪酸合成增加和氧化减少，加剧脂毒性和肝脏衰老。AMPK通过抑制mTOR调节自噬，HPS缺乏导致mTOR过度活化，破坏AMPK/mTOR平衡，损害自噬流。LKB1是肝脏中AMPK的主要上游激酶，HPS通过ERK-p90RSK通路诱导LKB1 Ser431磷酸化，促进其胞质转位和与AMPK结合。ANXA2被鉴定为介导HPS信号传导的膜相关受体，其敲低损害HPS诱导的下游信号。AICAR再激活AMPK可逆转衰老表型和恢复再生能力，证实AMPK是HPS抗衰老和促再生功能的核心介质。阻断自噬仅部分减弱AICAR的促再生效应，提示HPS同时通过自噬依赖和非依赖机制发挥作用。
HPS可选择性激活肝脏ERK1/2，相比广谱AMPK激动剂具有潜在安全性优势。药代动力学研究显示HPS吸收迅速（达峰时间0.25小时），半衰期约1.57小时，皮下生物利用度达100%。高剂量（20倍有效剂量）或连续给药7天未检测到明显毒性，AAV8介导的HPS过表达2个月亦未引起毒性，表明HPS具有良好的耐受性。循环和肝内HPS水平在老年人中均降低，提示重组HPS对接受肝切除或移植的老年患者具有潜在治疗价值。
**研究结论**：本研究发现HPS通过激活AMPK信号在保护肝脏免受衰老影响和维持老年小鼠再生能力方面发挥关键作用。这些结果凸显了HPS通路作为年龄相关肝脏疾病新型治疗靶点的潜力，为旨在增强肝再生和减轻年龄相关肝功能障碍的干预策略提供了理论依据。未来研究应致力于阐明HPS调节AMPK活性及其对自噬、代谢和再生过程下游效应的详细机制，为开发基于HPS的干预措施铺平道路。
