《Scientific Reports》：Leishmanicidal efficacy of cold atmospheric multiple plasma jet against Leishmania major in a murine model: effects on parasite burden, cytokine profiles, and wound healing
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皮肤利什曼病（Cutaneous leishmaniasis，CL）是一种被忽视的热带疾病，由于药物毒性、耐药性出现以及复杂的治疗方案，目前有效的治疗选择十分有限。冷大气多射流等离子体（Cold Atmospheric Multiple Plas
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皮肤利什曼病（Cutaneous leishmaniasis，CL）是一种被忽视的热带疾病，由于药物毒性、耐药性出现以及复杂的治疗方案，目前有效的治疗选择十分有限。冷大气多射流等离子体（Cold Atmospheric Multiple Plasma Jet，CAMPJ）作为一种新型治疗方式近来受到关注，因其能够产生活性氧和活性氮物种（Reactive Oxygen and Nitrogen Species，RONS），具有抗菌和免疫调节活性。本研究在BALB/c小鼠CL模型中评估了CAMPJ的治疗效果，重点关注其杀利什曼活性、创面愈合及免疫调节作用。雌性BALB/c小鼠接种硕大利什曼原虫（Leishmania major）前鞭毛体，待病灶形成后，将动物分为六组：两性霉素B局部用药组（阳性对照）、CAMPJ治疗组（分别处理5、10或15分钟）、未治疗对照组及空气处理对照组。CAMPJ和对照处理每周给药两次，持续21天，而两性霉素B每日给药。采用Digitizer软件每周监测病灶进展，通过利什曼-多诺万单位（Leishman-Donovan Units，LDU）定量寄生虫载量，并使用ELISA检测细胞因子水平（IFN-γ和IL-4）。与阴性对照组相比，CAMPJ治疗显著缩小了病灶尺寸（p < 0.05），其中15分钟暴露组改善最为显著。所有CAMPJ治疗组的脾脏寄生虫载量均显著降低，同样以15分钟组的LDU值最低。值得注意的是，15分钟CAMPJ暴露促进了Th1型免疫应答，表现为IFN-γ升高和IL-4降低，与未治疗对照组中占主导的Th2型特征形成鲜明对比。这些发现表明，CAMPJ具有较强的杀利什曼活性和有益的免疫调节作用，支持其作为CL替代或辅助疗法的潜力。
论文解读
一、研究背景与意义
利什曼病是由利什曼原虫属（Leishmania）原生动物寄生虫引起的一组传染病，广泛流行于热带和亚热带地区，全球约98个国家存在该病流行。据世界卫生组织估计，全球有1200万至1500万人感染利什曼病，每年新增皮肤利什曼病（CL）病例60万至100万例，内脏利什曼病（VL）新发病例5万至9万例，死亡人数约2万至3万人。CL约占所有利什曼病病例的70%至75%。
目前CL的一线治疗药物为五价锑类药物，如葡甲胺锑酸盐（Glucantime）和葡萄糖酸锑钠（Pentostam），二线药物包括米替福新、喷他脒、两性霉素B及唑类衍生物。然而，现有治疗方案面临诸多局限：注射方案复杂、疗效有限、成本高昂、毒性严重、治疗失败率高、耐药虫株出现风险以及明显的不良反应。世界卫生组织热带疾病研究计划已强调开发新型抗利什曼制剂的迫切需求。
近年来，冷大气等离子体（Cold Atmospheric Plasma，CAP）作为一种新兴的生物工程治疗技术受到关注。CAP是部分电离、接近室温的气体，含有活性氧和活性氮物种、带电粒子及紫外光子，能够在保护健康组织的同时发挥强效抗菌和抗寄生虫活性。此前已有体外研究探索冷等离子体对硕大利什曼原虫（L. major）、热带利什曼原虫（L. tropica）和杜氏利什曼原虫（L. donovani）的抗利什曼效果，但尚无体内研究评估冷等离子体对CL的疗效。本研究首次在BALB/c小鼠CL模型中系统评估冷大气多射流等离子体（CAMPJ）的治疗效果，具有创新性和重要的转化医学意义。
二、研究设计与技术方法
研究人员采用雌性BALB/c小鼠（4-6周龄，体重15-20 g，购自伊朗罗扬研究所），在小鼠尾根部皮下接种0.1 ml含2×10?个L. major（MRHO/IR/76/ER株）稳定期前鞭毛体的PBS悬液。接种28天后待结节和病灶明显形成，将30只感染小鼠随机分为六组（每组5只）：P-5组（CAMPJ处理5分钟）、P-10组（CAMPJ处理10分钟）、P-15组（CAMPJ处理15分钟）、阴性对照组（不处理）、装置对照组（500 A，仅通入500 ml/min空气气流但不激活等离子体）、阳性对照组（局部使用含4 mg/ml两性霉素B的脂质体凝胶，每日一次，持续四周）。CAMPJ处理每周两次，持续21天，工作距离固定为1 cm，工作电压8.6 kV，气体流速500 ml/min。
主要技术方法包括：采用Digitizer软件每周拍摄病灶照片并测量病灶面积；通过吉姆萨染色脾脏印片计数无鞭毛体，以利什曼-多诺万单位（LDU）公式计算寄生虫载量；利用Ficoll密度梯度离心从小鼠脾脏分离单个核细胞，经可溶性利什曼抗原（SLA）刺激72小时后，采用夹心ELISA法检测IFN-γ和IL-4浓度；使用Testo热像仪对等离子体反应器和靶组织进行红外热成像监测温度分布。统计分析采用SPSS 27进行单因素方差分析和Tukey事后检验，病灶进展采用重复测量方差分析。
三、研究结果
温度效应评估
在动物实验前，研究人员通过红外热成像验证了设备温度和等离子体处理对组织加热的潜在影响。结果显示，等离子体处理5、10、15分钟后，反应器最高温度分别达到79.8 °C、90.5 °C和95.4 °C，但在距反应器1 cm处的靶组织温度始终保持在约39 °C左右，随时间无明显变化。这证实CAMPJ在治疗过程中不会对靶组织造成热损伤。
病灶尺寸测量
治疗前各组间病灶大小无统计学显著差异（P > 0.05）。治疗后，所有等离子体处理组（5、10、15分钟）的创面尺寸均显著小于阴性对照组和装置对照组（P < 0.05）。等离子体处理组与阳性对照组之间无显著差异（P > 0.05）。虽然三个等离子体处理组之间未观察到统计学显著差异，但呈现明显的剂量依赖性效应：5分钟和10分钟暴露组病灶面积分别增加45.6%和44.8%，均显著低于未治疗阴性对照组；15分钟暴露组效果最佳，在整个研究期间几乎将病灶尺寸维持在恒定水平。装置对照组和未治疗阴性对照组表现出最大的平均病灶面积。
寄生虫载量评估
治疗结束后一周，采用LDU法检测小鼠脾脏寄生虫载量。等离子体治疗组和阳性对照组的寄生虫载量较阴性对照组和装置对照组显著降低（P < 0.0001）。10分钟和15分钟等离子体暴露组与阳性对照组相比差异具有统计学显著性（P < 0.001）。15分钟等离子体处理组在三个治疗组中寄生虫载量降幅最大（P < 0.01）。5分钟等离子体处理组与阳性对照组之间无显著差异（P > 0.05）。
细胞因子水平评估
ELISA检测结果显示，所有等离子体处理组（5、10、15分钟）的IFN-γ水平较阴性对照组和500 A装置对照组显著升高（P < 0.0001），其中15分钟暴露组IFN-γ水平最高（P < 0.01）。与阳性对照组相比，10分钟和15分钟等离子体处理组的IFN-γ水平显著更高，而5分钟组无显著差异（P < 0.05）。相反，所有等离子体处理组的IL-4水平较阴性对照组和500 A组显著降低（P < 0.0001），15分钟处理组IL-4浓度最低（P < 0.01）。与阳性对照组比较，10分钟和15分钟处理组IL-4水平显著更低，5分钟组无显著差异（P < 0.05）。
四、讨论与结论
讨论部分指出，CAMPJ治疗对L. major诱导的BALB/c小鼠CL表现出显著的治疗效果，体现在抑制病灶生长、降低脾脏寄生虫载量以及诱导Th1型免疫应答极化三个方面。CAMPJ的疗效呈明显的暴露时间依赖性，15分钟暴露组效果最佳，几乎完全抑制了病灶生长并稳定了创面尺寸。在寄生虫载量方面，15分钟组降幅最大，而5分钟组的疗效与阳性对照相当，提示较短时间的等离子体暴露可能仍具有临床有效性。细胞因子分析显示，CAMPJ治疗促使免疫应答向Th1方向极化，这对控制利什曼感染至关重要，因为IFN-γ可激活巨噬细胞清除胞内无鞭毛体，而IL-4则促进Th2应答、加重疾病进展。这些免疫调节效应可能与等离子体产生的活性物种影响炎症通路和巨噬细胞活化有关，但具体分子机制尚需进一步研究。
研究也存在局限性：病灶未完全愈合可能与CL的慢性特征、寄生虫持续存在及治疗时间相对较短有关；仅使用BALB/c小鼠可能限制免疫学发现的普适性；未区分杀寄生虫所需的ROS/RNS水平与潜在有害的氧化过度产生；未进行组织水平氧化应激或细胞毒性检测；Th1/Th2极化仅依据IFN-γ和IL-4 ELISA数据推断，未进行T细胞亚群的流式细胞术表征。
结论部分指出，在该小鼠模型中，局部CAMPJ治疗与未治疗对照组相比减少了病灶尺寸、降低了寄生虫载量，并诱导了与Th1偏向应答一致的细胞因子变化。这些发现共同证明，在所应用的实验条件下，CAMPJ对L. major具有可测量的治疗活性。然而，病灶愈合仍不完全，且本研究未评估长期结局、安全性参数或潜在复发，因此当前结果属于初步性质。未来需要进一步研究以优化给药方案、评估与现有抗利什曼药物的联合策略，并在更多动物模型中验证这些发现。总体而言，CAMPJ代表一种有前景的实验性方法，有待进一步确证性研究后有望发展为利什曼病未来的治疗选择。
