光动力免疫刺激根除厚层原发性色素化黑色素瘤并诱导持久系统性抗肿瘤免疫

《British Journal of Cancer》：Photodynamic immune stimulation eradicates primary pigmented melanoma and induces long-lasting anti-tumor immunity

　　

摘要

研究背景：黑色素瘤（melanoma）具有高度侵袭性，晚期疾病治疗选择有限。光动力疗法（photodynamic therapy, PDT）因受限于光穿透深度和黑色素瘤固有的活性氧（reactive oxygen species, ROS）抵抗性，在色素化黑色素瘤中疗效不佳。本研究探索了一种新的治疗策略。

研究方法：在具有完整免疫系统的同系DBA小鼠皮内接种全层（4 mm）S91色素化黑色素瘤，采用靶向肿瘤细胞和微血管的双重光敏剂（dual photosensitizers）联合局部光学清除剂（optical clearing agent, OCA）进行治疗。通过多种功能性实验研究抗肿瘤免疫效应，并探索其作用机制。

研究结果：所有小鼠的原发肿瘤均被根除，90天无病生存率达95%，而在治疗前进行CD8⁺ T细胞耗竭（CD8⁺ T-cell depletion）后，该生存率降至20%。裸鼠（nude mice）的中位生存期仅为21天。接受治疗的DBA小鼠在治疗后30天也能排斥全身性肿瘤再激发（re-challenge）。未经治疗的対侧肿瘤和与治疗后小鼠脾细胞（splenocytes）共同注射至初始小鼠（na?ve mice）的肿瘤均呈现生长延迟。生物标志物分析显示肿瘤内CD8⁺和CD3⁺ T细胞快速浸润，抑制性髓系细胞群减少，以及广泛免疫激活。基因表达谱分析揭示免疫相关通路的富集和持久免疫记忆的形成。

研究结论：光动力免疫刺激（photodynamic immune stimulation, PDIS）治疗能够摧毁远超光穿透深度的原发性色素化黑色素瘤，并具有强效的全身性抗肿瘤效能。

论文解读

**研究背景与科学问题**

黑色素瘤是一种起源于黑色素细胞（melanocytes）的高度侵袭性恶性肿瘤，主要累及皮肤。对于局限性病变，手术切除是标准治疗手段，五年生存率可达99%；然而一旦发生远处转移，五年生存率骤降至约30%。放疗和化疗在晚期黑色素瘤中疗效有限，而全方案免疫治疗（immunotherapy）因严重不良事件仅约50%的患者能够耐受，且应答率和生存获益差异显著。因此，临床迫切需要开发新型治疗策略。

光动力疗法（photodynamic therapy, PDT）利用光激活无毒性光敏剂（photosensitizers），通过产生活性氧（reactive oxygen species, ROS）包括激发态单线态氧（singlet oxygen），直接杀伤肿瘤细胞和/或破坏肿瘤微血管，是光化性角化病（actinic keratosis）的标准疗法，对皮肤基底细胞癌（basal cell carcinoma）的应答率可达约80%。然而，长期以来PDT被认为不适用于黑色素瘤等色素性病变。黑色素（melanin）作为双重屏障：其强光吸收和散射特性阻碍光向肿瘤深层穿透，同时其抗氧化功能快速中和ROS，限制细胞损伤。此外，许多黑色素瘤细胞主动外排光敏剂。为克服上述障碍，研究人员开发了一种双重光敏剂方案，同时杀伤肿瘤细胞并破坏肿瘤微血管，并选用已获临床批准的光敏剂以便于临床转化。此外，局部应用无毒光学清除剂（optical clearing agent, OCA）以降低光散射、改善组织穿透。在前期研究中，该策略在免疫缺陷小鼠模型中实现了厚度达1 mm的色素化皮内黑色素瘤的根除，但因转移播散未能转化为长期生存。为此，本研究进一步探索通过PDT诱导的免疫应答（PDT-induced immune response）提升治疗效果的可能性。

日益增多的临床前和临床证据表明，PDT可通过免疫原性细胞死亡（immunogenic cell death, ICD）等机制诱导强效抗肿瘤免疫应答。ICD是一种受调控的细胞死亡形式，通过释放肿瘤抗原和免疫刺激信号激活树突状细胞（dendritic cells, DCs），促进肿瘤特异性T细胞致敏（priming）。ICD的标志性特征是释放损伤相关分子模式（damage-associated molecular patterns, DAMPs），如钙网蛋白（calreticulin）、ATP和HMGB1，这些分子结合抗原呈递细胞（antigen-presenting cells）上的模式识别受体（pattern recognition receptors, PRRs），促进其募集和激活，进而启动强大的适应性免疫应答，将免疫学"冷"肿瘤转化为"热"肿瘤。

**研究目的与核心发现**

研究人员旨在验证上述双重光敏剂联合光学清除策略能否在远超有效光穿透深度的全层（3–4 mm）高度色素化黑色素瘤中根除原发肿瘤并通过免疫激活实现长期疾病控制。离体测量证实，690 nm治疗光在2 mm厚度S91色素化黑色素瘤组织中即发生4个对数级的光能量衰减，超过3 mm则无法检测到透射光。因此，3–4 mm厚肿瘤的实验结果可明确归因于免疫介导的肿瘤消退。

在具有完全免疫功能的DBA小鼠中，相同方案实现了原发肿瘤的完全根除，90天无病生存率达95%（19/20），显著优于所有既往关于PDT治疗色素化黑色素瘤的临床和临床前报道。相比之下，所有免疫缺陷裸鼠均死于肿瘤过度生长，生存期无统计学改善。这一显著差异只能归因于适应性免疫应答的贡献。CD8⁺ T细胞耗竭实验进一步证实了这一点：83%的耗竭小鼠在治疗后34天内死于原发肿瘤进展。

**主要关键技术方法**

研究使用S91小鼠黑色素瘤细胞系（ATCC CCL-53.1），在雄性DBA免疫健全小鼠和J/Nu裸鼠（Jackson Labs）皮内注射10⁶个细胞建立肿瘤模型，当肿瘤经高频超声（55–70 MHz）测量达到3–4 mm厚度时进行治疗。治疗采用两种临床批准的光敏剂经尾静脉序贯给药：Photodithazine（PDZ，二氢卟吩e6的葡胺盐，1.0 mg/kg）优先靶向肿瘤细胞，Visudyne（苯并卟啉脂质体制剂，0.8 mg/kg）靶向微血管。局部应用由PEG-400和1,2-丙二醇（19:1）组成的光学清除剂。光照参数为670 nm（80 mW/cm²，500 s，40 J/cm²）和690 nm（100 mW/cm²，500 s，50 J/cm²）序贯照射。免疫分析采用多参数流式细胞术（flow cytometry）、多重酶联免疫吸附试验（multiplex ELISA）、免疫组织化学（immunohistochemistry）。转录组分析采用NanoString nCounter^?小鼠免疫学芯片。功能性验证包括CD8⁺ T细胞体内耗竭、过继免疫转移（adoptive immune transfer）、远隔效应（abscopal effect）观察和全身再激发实验。

**研究结果**

*光在离体色素化黑色素瘤组织中的穿透*：离体S91黑色素瘤组织的光传输测量显示，690 nm光在2 mm厚度处衰减4个对数级，超过3 mm则无法检测。PDIS实验在3–4 mm厚肿瘤上进行，以明确证实免疫刺激对超出直接PDT杀伤深度之外肿瘤消退的贡献。

*治疗应答*：DBA小鼠在治疗后6小时出现剧烈局部炎症，3天内形成溃疡，18–20天完全愈合且无肉眼可见或可触及的肿瘤证据。免疫缺陷裸鼠仅见表浅损伤。治疗后DBA小鼠95%在最长90天随访中保持存活无病，而对照组中位生存仅21天；裸鼠治疗组与对照组生存无差异。

*免疫生物标志物*：血浆细胞因子和趋化因子检测显示，治疗后上皮源性中性粒细胞激活肽78（ENA-78）、白细胞介素-2（IL-2）、白细胞介素-6（IL-6）、生长调节癌基因α（GRO-α）和白细胞介素-18（IL-18）出现显著动态变化。外周血中嗜酸性粒细胞（eosinophils）显著增多，B细胞（CD45⁺CD19⁺）和T细胞（CD45⁺CD3⁺）减少，活化T细胞（CD69⁺）比例升高，包括CD69⁺CD8⁺和CD69⁺CD4⁺ T细胞，提示适应性免疫激活。

*肿瘤引流淋巴结免疫细胞动态*：自然杀伤细胞（NK cells）增加约1.4倍，F4/80⁺巨噬细胞扩增2–4.7倍，Gr-1⁺CD11b⁺髓系细胞增加3–20倍，CD11c⁺MHC-II⁺和CD11c⁺MHC-I⁺抗原呈递细胞分别增加4倍和2倍。记忆表型分析显示初始T细胞（CD62L⁺CD44^?）和中央记忆T细胞（CD62L⁺CD44⁺）减少，效应记忆T细胞（CD62L^?CD44⁺）随时间增加，表明功能性抗肿瘤免疫应答的成熟。

*肿瘤免疫细胞浸润*：流式细胞术显示肿瘤浸润CD3⁺ T细胞和CD19⁺ B细胞分别在治疗后3和6小时达峰，免疫抑制性Ly-6G⁺Ly-6C⁺CD11b⁺髓系细胞显著减少。免疫组化证实T细胞在12小时大量浸润并分布于肿瘤实质全层，包括中央区域。

*转录组分析*：治疗后24小时基因表达变化最为显著。基因本体论（Gene Ontology, GO）富集分析显示淋巴细胞分化、造血调控、细胞因子介导的信号传导、白细胞增殖、髓系细胞分化以及T细胞活化和淋巴细胞增殖的正调控等通路显著上调。KEGG通路分析富集到IL-17信号通路、趋化因子信号、自然杀伤细胞介导的细胞毒性、T细胞受体信号、Toll样受体信号、B细胞受体信号和Th1/Th2/Th17细胞分化等关键免疫通路，以及凋亡和细胞衰老相关通路。

*功能性免疫应答*：CD8⁺ T细胞耗竭后，83%的小鼠死于肿瘤进展，中位生存21.5天，虽短于未耗竭组但仍长于未治疗对照组（中位9天），提示CD4⁺ T细胞、B细胞和固有免疫细胞也参与肿瘤抑制。过继免疫转移实验显示，治疗后小鼠脾细胞与肿瘤细胞共注射至初始小鼠可显著延迟肿瘤生长，证实肿瘤特异性免疫记忆。远隔效应实验中，未经治疗的对侧肿瘤生长延迟，中位生存从6天延长至15天。再激发实验中，治疗后45天的小鼠经静脉注射10⁶个S91细胞后30天仍无肿瘤，而对照组全部出现广泛肺和腹膜转移。

**讨论与结论**

本研究首次在数倍于有效光穿透深度的色素化黑色素瘤中证明，局部PDT联合双重光敏剂方案可诱导强效抗肿瘤免疫应答，这种"光动力免疫刺激"能根除全层原发肿瘤并显著延长生存。生物标志物、功能性实验和基因表达分析结果一致表明，利用和调控免疫系统是治疗成功的关键所在。

研究人员提出以下事件序列：靶向肿瘤细胞的光敏剂首先激活，导致肿瘤浅层细胞死亡，随后血管靶向PDT增强损伤。虽然仅约1 mm厚度的肿瘤接受有效光剂量（高于坏死阈值）被直接破坏，但该层内诱导的损伤释放DAMPs，触发固有和适应性免疫细胞募集至肿瘤部位，最终建立持久抗肿瘤免疫。光穿透梯度可能诱导不同的细胞死亡通路，从而促进强效免疫应答——这正在进一步研究中。

研究局限包括仅使用雄性小鼠（已知其免疫应答弱于雌性）和单一黑色素瘤细胞系（S91），可能无法完全反映人类黑色素瘤的遗传异质性和临床相关突变。未来需在更多临床前模型中评估PDIS效能。在临床转化方面，PDIS可作为新辅助治疗在手术切除前应用，利用围手术期窗口减少免疫抑制，或联合免疫检查点抑制剂（immune checkpoint inhibitors, ICIs）将"冷"肿瘤转化为"热"肿瘤。此外，将免疫生物标志物（CD8⁺和CD3⁺ T细胞浸润、CD69⁺活化状态、血浆细胞因子和ICD相关DAMP特征）整合入光剂量学模型，有望优化治疗计划和实时疗效评估。该策略还可能拓展至葡萄膜黑色素瘤（uveal melanoma）及其他对现有免疫治疗耐药的肿瘤类型（如胰腺癌和肺癌）。

研究结论：本研究首次证明，在数倍于最大有效光穿透深度的色素化黑色素瘤中，采用双重光敏剂方案靶向肿瘤细胞和肿瘤微血管的局部PDT治疗可诱导强效抗肿瘤免疫应答。这种光动力免疫刺激根除了全层原发治疗肿瘤，尽管直接PDT肿瘤破坏因光穿透受限仅局限于表层约1 mm。该治疗显著提高生存率，并产生显著的系统性抗肿瘤效能。因此，PDIS作为一种新型免疫治疗策略具有前景，因其低毒性可与现有治疗方式整合，并通过免疫生物标志物引导进行优化。未来在其他临床相关肿瘤模型中的研究和该治疗方式的治疗计划优化是向临床转化以改善患者预后的关键步骤。