海藻酸盐/壳聚糖/大麻二酚水凝胶对牙髓干细胞成骨响应的影响：基于OPG/RANKL轴的选择性蛋白滞留机制研究

《Gels》：Osteogenic Response of Dental Pulp Stem Cells (DPSCs) to an Alginate/Chitosan/Cannabidiol Hydrogel

　　

摘要专业翻译 本研究评估了牙髓干细胞（dental pulp stem cells，DPSCs）在三维打印海藻酸盐/壳聚糖/大麻二酚（cannabidiol，CBD）水凝胶中培养时的成骨分化及旁分泌响应。研究人员将来自单一供体的DPSCs（第6代；每个条件n = 3个技术重复）以单层或水凝胶构建体（CBD浓度0–12 mg/mL）形式，在基础培养基或成骨培养基中培养7、14和21天。茜素红S染色证实了成骨能力的保留。采用Luminex免疫分析定量检测上清液中的骨保护素（osteoprotegerin，OPG）和核因子κB受体活化因子配体（receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL）。单层培养产生的OPG高达7867.5 ± 676.8 pg/mL，而水凝胶培养仅产生9.7–69.3 pg/mL（减少98–99.8%；p < 0.001）。RANKL在所有条件下均稳定在9–11 pg/mL；两种分析物均不随CBD浓度变化。OPG/RANKL比值从215–858骤降至水凝胶组的1.0–6.3。由于RANKL——由同一细胞共分泌——未受影响，因此难以用普遍的细胞或分泌功能缺陷来解释OPG的选择性降低。该数据与阳离子OPG（等电点pI ≈ 8.5–9.0）在海藻酸盐阴离子网络内的电荷选择性滞留机制相一致，尽管该机制仍有待直接吸附实验和ζ电位验证。这些发现表明，支架固定电荷是三维培养物表观分泌组中的一个活跃变量。

论文解读

一、研究背景与研究目的

骨组织再生是再生医学领域的重大挑战，尤其对于超出自然修复能力的临界尺寸骨缺损而言。颌面部及口腔内的骨缺损常由创伤和牙周炎等疾病导致，2021年全球牙周炎患者超过十亿人，患病率高达12.50%，新增病例近9000万。口腔癌治疗往往需要大面积骨切除，同样造成临界尺寸骨缺损。近年来，骨组织工程的研究重点转向三维打印支架，通过模拟组织的生物学、力学和化学特征来促进骨再生。水凝胶因其亲水性、生物相容性的三维聚合物网络和可定制的多孔结构而成为骨组织工程的重要选择。

海藻酸盐和壳聚糖可通过静电相互作用形成稳定、可调的水凝胶网络，具有高生物相容性、可控生物降解性、原位凝胶化能力，并能促进细胞黏附和生长。大麻二酚（cannabidiol，CBD）作为生物信号分子，可通过p38 MAPK通路诱导成骨细胞分化，加速体内骨痂矿化，增强人间充质祖细胞的活力和成骨基因表达，并能恢复被TNF-α或LPS抑制的牙髓干细胞（dental pulp stem cells，DPSCs）的骨/成牙本质分化能力。

尽管海藻酸盐/壳聚糖支架、CBD诱导成骨以及DPSCs的高再生潜力均已得到充分研究，但这三种组分在单一高分子网络中的相互作用机制仍不清楚。骨保护素（osteoprotegerin，OPG）/核因子κB受体活化因子配体（receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL）轴是骨保护与骨吸收信号之间的平衡指标，高比值抑制破骨细胞生成、有利于骨保存，低比值则促进破骨细胞形成和骨吸收。DPSCs具有显著以OPG为主的分泌特征，其OPG产生量是牙槽骨细胞的两倍以上，而RANKL分泌量约为其二十分之一。因此，阐明这三种组分在单一网络中的相互作用，对于推进颌面骨组织工程的细胞治疗策略至关重要。本研究的目的是评估牙髓干细胞在与海藻酸盐/壳聚糖/CBD水凝胶接触时的成骨分化能力。

二、研究内容与主要结论

研究人员将来自单一19岁男性健康供体的第6代DPSCs以每孔10,000个细胞的密度接种于24孔板中，在基础培养基或成骨培养基中，以二维单层培养或与不同CBD浓度（0–12 mg/mL）的海藻酸盐/壳聚糖水凝胶构建体接触培养，分别于第7、14和21天进行评估。通过茜素红S染色评估成骨分化能力，采用Luminex多重免疫分析定量检测上清液中的OPG和RANKL浓度。研究发现，水凝胶接触导致上清液中可检测的OPG水平显著降低98–99.8%（p < 0.001），而RANKL在所有条件下均稳定维持在9–11 pg/mL。OPG/RANKL比值从单层培养的215–858骤降至水凝胶组的1.0–6.3。研究人员提出电荷选择性滞留假说：OPG（pI ≈ 8.5–9.0）在生理pH下带正电荷，与海藻酸盐阴离子网络中的羧酸根（COO?）发生静电吸附而被滞留在基质内；而RANKL（pI ≈ 5.0–6.0）带负电荷，与阴离子基质产生静电排斥而自由扩散至上清液。该发现具有重要意义：支架固定电荷是三维培养物表观分泌组中的活跃变量，可作为将内源性抗破骨细胞生成信号定位于细胞周围的潜在设计原则。

三、主要关键技术方法

本研究采用的主要技术方法包括：三维打印海藻酸盐/壳聚糖水凝胶构建体的制备与离子交联；DPSCs的分离、培养与免疫表型鉴定（阳性标记物CD90、CD73、CD29、CD146；阴性标记物CD45、CD324）及三系分化潜能确认；茜素红S染色评估矿化沉积；基于Luminex xMAP技术的磁珠多重免疫分析定量检测OPG和RANKL浓度；以及Student's t检验和单因素方差分析（ANOVA）进行统计分析。细胞来源为Pontificia Universidad Javeriana牙科研究中心（CIO-PUJ）捐赠的健康牙齿牙髓组织。

四、研究结果

2.1 常规培养与三维培养中DPSC成骨分化的确定

通过茜素红S染色观察各时间点的矿化沉积情况。在水凝胶存在的孔中，染色信号同时出现在水凝胶内部和增殖细胞中。由于水凝胶基质本身通过Ca2?离子交联，茜素红S可螯合钙离子，因此凝胶内的信号不能完全归因于细胞来源的羟基磷灰石。矿物特异性读数仅限于水凝胶移除后留在聚苯乙烯表面的细胞层，该区域不含Ca2?交联聚合物，非诱导培养的阴性对照始终为阴性。染色结果作为DPSCs与水凝胶接触时成骨能力的定性证据。

2.2 OPG/RANKL产生

在第7天，基础培养基中无水凝胶的DPSCs产生3558.0 ± 556.2 pg/mL的OPG，接触对照水凝胶（0 mg/mL CBD）后降至69.3 ± 1.5 pg/mL，减少98%；成骨培养基中从2799.8 ± 836.0 pg/mL降至21.3 ± 1.2 pg/mL，减少99%。第14天，基础培养基从2424.2 ± 1014.9 pg/mL降至9.7 ± 0.6 pg/mL（减少99.6%），成骨培养基从1939.2 ± 746.6 pg/mL降至10.7 ± 1.5 pg/mL（减少99.4%）。第21天抑制最为显著，基础培养基从7867.5 ± 676.8 pg/mL降至15.7 ± 1.5 pg/mL（减少99.8%），成骨培养基从6195.0 ± 811.9 pg/mL降至11.7 ± 2.1 pg/mL（减少99.8%）。CBD浓度（0.1–12 mg/mL）对OPG或RANKL均无单调浓度依赖性影响。水凝胶组的变异系数（CV）显著低于常规培养组，表明三维基质提供了更均匀的微环境。RANKL在所有条件下均稳定在9–11 pg/mL，唯一例外是第21天成骨单层组升至13.67 ± 0.52 pg/mL，虽具统计学显著性但生物学意义可忽略。OPG/RANKL比值从单层培养的215–858降至水凝胶组的1.0–6.3，表明水凝胶导致的比值骤降反映的是基质介导的蛋白再分布而非促破骨细胞生成转变。

五、讨论总结与结论翻译

讨论部分指出，上清液中OPG的可检测水平显著降低最可能的原因是海藻酸盐-壳聚糖聚电解质网络内的静电吸附。该归因基于多方面的间接证据：OPG的等电点（pI ≈ 8.5–9.0）使其在生理pH下带正电荷，与海藻酸盐的阴离子羧酸根基团产生离子相互作用；OPG通过其C端肝素结合域中的8个碱性残基以纳摩尔级亲和力结合肝素和硫酸乙酰肝素，海藻酸盐基质可作为糖胺聚糖模拟储库，通过相同的生理界面捕获OPG。而RANKL（pI ≈ 5.0–6.0）在pH 7.4时带净负电荷，与阴离子海藻酸盐基质产生静电排斥而保持可扩散性。该水凝胶的孔径（12.81 ± 4.80 μm至16.39 ± 6.52 μm）比OPG（55 kDa）和RANKL（33 kDa）的水动力学尺寸大约三个数量级，排除了空间筛分效应。FTIR证实海藻酸盐过量时网络保持净负表面电荷和丰富的游离羧酸根基团。研究人员也承认了多项局限性：所有数据来自单一供体（第6代，技术三重复）；成骨分化仅通过茜素红S定性评估，缺乏无细胞对照和ALP定量；电荷选择性滞留机制有待吸附等温线、质量平衡定量和ζ电位测量直接验证；CBD释放动力学和基质降解特性尚未表征。此外，RANKL测量接近检测下限（5.0 pg/mL），属于半定量而非完全定量。

研究结论为：海藻酸盐/壳聚糖/CBD水凝胶支持DPSCs的成骨定向，并在培养上清液中产生了OPG与RANKL之间选择性、可重复的解离：OPG下降98–99.8%（p < 0.001），而RANKL在所有时间点均稳定在9–11 pg/mL。由于普遍的细胞功能缺陷会使两种分析物成比例下降，最简洁的解释是阳离子OPG（pI ≈ 8.5–9.0）在阴离子网络内的电荷选择性滞留，同时阴离子RANKL（pI ≈ 5.0–6.0）被排除在外。该观察表明，聚电解质支架中上清液OPG/RANKL比值的骤降反映的是基质介导的再分布而非促破骨细胞生成的转变，并确定了大分子电荷架构作为在细胞周围水平定位抗吸收信号的潜在设计原则。通过吸附等温线、质量平衡定量和跨独立供体的重复验证，将界定该发现的转化应用范围。