IgA缺陷加剧Theiler's病毒诱导的多发性硬化症动物模型

《Cells》：IgA Deficiency Exacerbates an Animal Model of Multiple Sclerosis Induced with Theiler’s Virus

　　

专业术语翻译的论文摘要 多发性硬化症（multiple sclerosis，MS）是一种免疫介导性疾病，其特征是中枢神经系统（central nervous system，CNS）的炎性脱髓鞘和轴突变性，并与病毒感染有关。SJL/J小鼠的Theiler's鼠脑脊髓炎病毒（Theiler's murine encephalomyelitis virus，TMEV）感染已被广泛用作MS的病毒模型，因为TMEV感染的小鼠会发展出类似MS的脱髓鞘和轴突变性，并在CNS中持续存在病毒。在TMEV模型中，研究人员此前已证明CNS中免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）A相关基因的上调，以及在脱髓鞘病变中的IgA沉积和IgA阳性细胞浸润。尽管IgA已被认为与MS的病理生理学有关，但其确切作用仍不清楚。为了确定IgA在TMEV模型中的作用，研究人员在SJL/J背景下建立了IgA敲除（knockout，KO）小鼠；IgA KO小鼠缺乏血清IgA，并表现出改变的肠道微生物群组成。研究人员发现，与野生型（wild-type，WT）小鼠相比，TMEV感染的IgA KO小鼠出现了更严重的神经症状。IgA KO小鼠还比WT小鼠表现出更严重的炎性脱髓鞘，伴有更高水平的CNS病毒持续存在和T细胞浸润。从免疫学角度看，除了IgA之外，IgA KO小鼠产生的TMEV特异性淋巴细胞增殖反应和血清抗病毒抗体同种型滴度与WT小鼠相当。IgA KO小鼠的白细胞介素（interleukin，IL）-17和IL-10的产生高于WT小鼠。因此，在WT小鼠的TMEV模型中，IgA可能发挥保护作用；而IgA缺陷介导的肠道菌群失调可能促进了IgA KO小鼠中增强的免疫病理学。

论文解读文章

研究背景与研究目的

多发性硬化症（multiple sclerosis，MS）是一种以中枢神经系统（central nervous system，CNS）炎性脱髓鞘和轴突变性为特征的免疫介导性疾病。其确切发病机制尚不明确，但被认为与失调的免疫应答和病毒感染之间的相互作用有关。Theiler's鼠脑脊髓炎病毒（Theiler's murine encephalomyelitis virus，TMEV）感染SJL/J小鼠被广泛用作MS的病毒模型，该模型会在感染约一个月后（慢性期）出现CNS中病毒持续存在伴随的炎性脱髓鞘和轴突变性。在该模型中，研究人员先前已发现CNS中免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）A相关基因（如Igha和Jchain）的表达上调，以及在脱髓鞘病变中存在IgA沉积和IgA阳性（IgA⁺）细胞浸润。此外，IgA已知能调节肠道微生物群的组成，而肠道菌群失调（dysbiosis）与多种免疫介导疾病相关。临床研究发现，MS患者脑脊液（cerebrospinal fluid，CSF）中IgA浓度升高，且活动期MS患者粪便中IgA结合细菌的频率低于非活动期患者。然而，IgA在MS病理生理学中的确切作用尚不清楚。因此，本研究旨在通过在SJL/J背景下建立IgA敲除（knockout，KO）小鼠，探讨IgA缺陷对TMEV模型的影响，以阐明IgA在MS样疾病中的潜在作用。

主要研究方法

1. 1.
   动物模型建立：研究人员利用CRISPR/Cas9介导的基因组编辑技术，在SJL/J小鼠背景下定制生成了IgA KO小鼠。随后，将2 × 10⁵空斑形成单位（plaque-forming units，PFUs）的Daniels（DA）株TMEV经颅内（intracerebrally，i.c.）接种至5-6周龄的野生型（wild-type，WT）和IgA KO小鼠，并观察2个月。实验获得日本近畿大学医学院动物护理和使用委员会的批准。
2. 2.
   酶联免疫吸附试验（ELISA）：用于定量血清中抗体同种型浓度及抗TMEV抗体同种型滴度。
3. 3.
   组织病理学与免疫组织化学：采用Luxol fast blue染色评估CNS脱髓鞘；苏木精和伊红（H&E）染色观察一般器官形态；通过免疫组化检测IgA、TMEV抗原、CD3⁺ T细胞以及受损轴突（使用非磷酸化神经丝抗体SMI 311）。
4. 4.
   微生物组分析：收集na?ve WT和IgA KO小鼠的粪便，提取DNA后进行16S rRNA扩增子测序（V3-V4区域），并使用QIIME 2进行生物信息学分析，包括α多样性指数（Faith's PD、Pielou's evenness、Shannon指数）计算和主成分分析（principal component analysis，PCA）。
5. 5.
   淋巴细胞增殖试验与细胞因子ELISA：分离TMEV感染小鼠的脾脏单个核细胞（mononuclear cells，MNCs），分别用活TMEV或刀豆蛋白A（concanavalin A，ConA）刺激，检测淋巴细胞增殖反应（使用Cell Counting Kit-8）及培养上清中干扰素（IFN）-γ、白细胞介素（IL）-17A、IL-4和IL-10的浓度。

研究结果

3.1 在SJL/J背景下生成IgA KO小鼠

通过ELISA确认IgA KO小鼠血清中无IgA，且血清IgM和IgG1浓度与WT小鼠相当，但IgG2c浓度显著升高。4-5周龄的IgA KO小鼠体重显著轻于同龄WT小鼠，但组织学检查显示胸腺、心脏、脾脏、肝脏、肾脏和肠道均无病理改变。

3.2 IgA KO小鼠的肠道微生物群组成与WT小鼠不同

α多样性分析显示，IgA KO小鼠的Faith's PD指数和Shannon指数显著高于WT小鼠，表明细菌丰富度和综合多样性增加。PCA分析在属水平上清晰区分了两组小鼠的微生物群谱，其中属于拟杆菌目（Bacteroidales）的多个菌属（如Muribaculaceae (UBA3263)、Caccoplasma、Paramuribaculum等）对分离贡献最大。相对丰度比较发现，IgA KO小鼠中拟杆菌目多个菌属的相对丰度显著高于WT小鼠。

3.3 IgA缺陷加剧了TMEV诱导的脱髓鞘疾病（TMEV-IDD）

在急性期（感染后1周），两组小鼠的神经症状（右正反射评分）相似。但在慢性期（感染后1-2个月），IgA KO小鼠的右正反射评分显著高于WT小鼠，表明神经症状更严重。病理学分析显示，IgA KO小鼠脊髓中的脱髓鞘和脑膜炎评分显著高于WT小鼠，血管周围套袖评分也有增高趋势（p=0.06）。免疫组化证实WT小鼠病变处有IgA⁺细胞浸润和IgA沉积，而IgA KO小鼠则无。

3.4 IgA缺陷增强了TMEV-IDD中CNS的病毒持续存在和T细胞浸润

免疫组化结果显示，TMEV抗原阳性（TMEV antigen⁺）细胞主要位于脊髓白质。IgA KO小鼠在脊髓腹索和侧索中的病毒抗原阳性细胞数量显著多于WT小鼠。同样，CD3⁺ T细胞在IgA KO小鼠脊髓腹索和侧索的浸润也显著增加。然而，两组间受损轴突的数量无显著差异。

3.5 IgA缺陷改变了细胞因子谱，但不影响抗病毒免疫应答

血清抗TMEV抗体同种型滴度检测显示，除IgA外，IgM、IgG1和IgG2c滴度在两组间相当。TMEV特异性淋巴细胞增殖反应在两组间也无显著差异。在细胞因子方面，TMEV刺激下，IgA KO小鼠的IFN-γ和IL-10产生水平高于WT小鼠，但未达统计学意义。在ConA刺激下，IgA KO小鼠的IL-17和IL-10产生水平显著高于WT小鼠，而IFN-γ和IL-4水平无差异。

讨论与结论总结

本研究表明，在SJL/J背景下的IgA KO小鼠中，IgA缺陷导致了肠道微生物群组成的改变和α多样性的增加，这与一些选择性IgA缺陷（selective IgA deficiency，sIgAD）患者的临床发现一致。在TMEV感染模型中，IgA缺陷加剧了慢性期的神经症状和脊髓炎性脱髓鞘，同时增加了CNS中的病毒持续存在和T细胞浸润。这种加剧效应可能与IgA缺陷导致抗病毒IgA抗体缺失有关，从而削弱了对CNS中病毒扩散的控制。此外，IgA缺陷小鼠中升高的促炎细胞因子（IFN-γ和IL-17）可能进一步促进了免疫病理损伤。尽管IL-10水平也升高，但在该模型慢性期，其可能未能有效抑制炎症，反而可能与增加的病毒持续存在相关。研究人员得出结论：在WT小鼠的TMEV模型中，IgA可能通过中和CNS中的TMEV发挥保护作用；此外，IgA缺陷介导的肠道菌群失调也可能通过破坏免疫平衡而促进了增强的免疫病理学。这些发现为理解IgA在MS及相关病毒模型中的作用提供了新的见解，提示IgA可能是一个潜在的治疗靶点。