橄榄叶提取物对人小细胞肺癌（SCLC）与非小细胞肺癌（NSCLC）的差异性效应及其与顺铂的协同作用：作为患者食品补充剂的可行性依据

《Cells》：Differential Effects of Olive Leaf Extract on Human Small and Non-Small Cell Lung Cancer and Synergy with Cisplatin: Rationale for Its Potential Use as Food Supplement for Patients?

　　

肺癌分为非小细胞肺癌（Non-Small Cell Lung Cancer, NSCLC）和小细胞肺癌（Small Cell Lung Cancer, SCLC），仍是全球癌症相关死亡的主要原因。NSCLC和SCLC患者的预后严峻，因此需要新型疗法。在此背景下，植物来源化合物，如橄榄叶提取物（olive leaf extract, OLE），因其抗癌特性近期引起了广泛关注。研究人员探讨了OLE对NSCLC和SCLC细胞系的细胞增殖和凋亡（通过流式细胞术）及迁移（通过划痕试验和Transwell实验）的影响，并阐明其相关机制。同时评估了OLE与顺铂的协同效应。OLE对肺癌细胞系的细胞增殖和凋亡产生了差异性影响。值得注意的是，此类效应在SCLC细胞系中高于NSCLC细胞系。进一步分析以GLC-1和SKMES细胞为对象，分别鉴定为OLE敏感和OLE耐受模型。实际上，OLE仅在GLC-1细胞中通过激活裂解的caspase-9、-3和-7触发内源性凋亡通路，并诱导DNA损伤应答和细胞应激分子。相反，OLE影响了SKMES细胞系的迁移能力，并调节了应激适应和存活通路。最后，OLE与顺铂在诱导GLC-1细胞凋亡方面表现出协同作用。OLE在体外对肺癌细胞发挥了多重抗肿瘤效应。其增强顺铂诱导凋亡的能力支持进一步研究OLE作为化疗的潜在膳食辅助手段。虽然OLE已有确定的安全性数据，但在任何临床应用之前，仍需体内研究验证其功效并评估其与化疗药物的潜在相互作用。

**论文解读**

**研究背景与科学问题**

肺癌是全球癌症相关死亡的首要原因，2022年约有250万新发病例。根据世界卫生组织（World Health Organization, WHO）标准，肺癌主要分为非小细胞肺癌（Non-Small Cell Lung Cancer, NSCLC）和小细胞肺癌（Small Cell Lung Cancer, SCLC）两大类。NSCLC约占所有病例的80%–85%，可进一步分为腺癌、鳞状细胞癌和大细胞癌；SCLC约占10%–15%，是一种高级别神经内分泌肿瘤，以快速增殖、早期转移和重度吸烟史为特征。尽管系统治疗有所进展，晚期患者的预后仍然很差，5年生存率仅为5%–10%。以顺铂或卡铂为基础的双药化疗曾是晚期疾病的标准方案，但伴随多种副作用和耐药问题，因此寻找能够增强化疗细胞毒性效应的植物来源天然化合物具有重要价值。

橄榄叶提取物（olive leaf extract, OLE）因其富含多种植物化学物质而受到科学界的关注。虽然橄榄苦苷（oleuropein）是其主要生物活性成分，占提取物干重的17%–25%，但全叶提取物往往比单一化合物更具生物效应，因为其多种成分可同时作用于不同细胞通路。已有研究表明橄榄苦苷能够通过激活p38 MAPK信号通路抑制NSCLC细胞（如A549）活力，诱导G₂/M期细胞周期阻滞并触发内源性线粒体凋亡通路。然而，关于全OLE对A549细胞及其他类型肺癌的抗肿瘤活性尚无报道。因此，本研究旨在探讨OLE对人肺肿瘤的抗肿瘤活性，包括抑制细胞增殖、单独或联合顺铂诱导凋亡、抑制细胞迁移以及调节促凋亡和抗凋亡分子，以评估OLE作为肺癌患者膳食补充剂的潜力。

**主要技术方法**

本研究使用了6种人肺癌细胞系，包括4种NSCLC细胞系（肺腺癌细胞系A-549、CALU-6和GLC-82，肺鳞状细胞癌细胞系SKMES）和2种SCLC细胞系（GLC-1和GLC-4），细胞系均购自ATCC和意大利热那亚San Martino医院生物样本库。OLE由Evergreen Life公司提供，采用低温专利提取工艺，其中橄榄苦苷浓度为2656 mg/L。细胞增殖通过CFSE标记结合流式细胞术评估；凋亡采用Annexin V-FITC/7AAD双染流式细胞术检测；裂解caspase-3、-7、-9的激活通过特异性荧光标记抗体流式分析；分子通路采用人凋亡蛋白组芯片（检测35种凋亡相关蛋白）和人磷酸激酶芯片（检测37种磷酸化激酶）进行抗体阵列分析；细胞周期通过BrdU掺入结合7AAD染色分析；OLE与顺铂的联合效应通过SynergyFinder+网络应用的HSA模型评估；迁移能力以划痕试验（贴壁细胞）和Transwell侵袭实验（悬浮细胞）检测，使用Livecyte仪器进行实时无标记单细胞分割分析。

**研究结果**

*3.1 OLE以剂量依赖方式抑制肺癌细胞系增殖*

研究人员将6种肺癌细胞系在不同浓度OLE（50–400 μM）中培养6天。结果显示SCLC与NSCLC行为不同：GLC-1和GLC-4在所有OLE浓度下均呈现统计学显著的增殖抑制，而NSCLC仅显示抑制趋势，显著生长抑制主要出现在最高浓度（400 μM），CALU-6细胞系例外，自100 μM起即被抑制。SKMES鳞癌细胞仅对400 μM OLE呈现轻微但显著的增殖减少。

*3.2 OLE对肺癌细胞凋亡的差异性效应*

凋亡分析表明，GLC-1 SCLC细胞对OLE最为敏感，自100 μM起在任何时间点（24、48和72小时）均诱导早期和晚期凋亡。GLC-4细胞较耐受，仅在400 μM处理72小时后出现显著的早期凋亡增加，未观察到显著的晚期凋亡。NSCLC细胞系中，CALU-6和GLC-82在400 μM OLE处理下出现早期凋亡，但晚期凋亡仅在CALU-6细胞中于400 μM处理72小时后被显著诱导。A549仅在72小时、200和400 μM OLE条件下显示早期凋亡，且无晚期凋亡。SKMES细胞在所有时间点均未检测到早期或晚期凋亡。据此，GLC-1被确定为OLE敏感模型，SKMES为OLE耐受模型。

*3.3 OLE对GLC-1 SCLC凋亡信号网络的影响*

在GLC-1细胞中，200 μM OLE处理24和48小时后，裂解caspase-9、-3和-7均被显著上调，表明内源性线粒体凋亡通路被完全激活。抗体阵列分析揭示OLE诱导了p27^Kip1（增加80.3%）、磷酸化RAD17（增加74.2%）、热休克蛋白HSP-32/HO-1（增加50.2%）和HSP-60（增加518.5%）的表达，提示细胞周期抑制和DNA损伤应答及细胞应激反应的激活。同时，OLE诱导了p70 S6激酶、CHK2、WNK1、CREB等应激相关激酶的磷酸化，并导致GSK3α（Ser9）和GSK3β（Ser21）的抑制性磷酸化。

*3.4 OLE对SKMES NSCLC信号网络的调节*

SKMES细胞中，裂解caspase-3、-7和-9均未被OLE显著诱导，与凋亡检测结果一致。但抗体阵列显示clusterin（增加59%）和过氧化氢酶（catalase，增加134.5%）上调，同时细胞色素c（增加51.2%）、cIAP（增加71.9%）、Bcl-xL（增加73.3%）和HIF-1α（增加52.1%）等抗凋亡及促存活分子的表达增加，而β-catenin降低64.7%。磷酸激酶方面，STAT3（增加115%）、ERK1/2（增加95%）和eNOS（增加78.3%）被激活，呈现促存活效应；GSK3α/β被抑制性磷酸化，而WNK1则降低50.3%。

*3.5 OLE差异性影响GLC-1和SKMES细胞周期*

OLE处理48小时后，GLC-1细胞G₀/G₁期细胞比例显著降低（从62.06%降至11.26%），S期细胞大量增加（从0.35%升至59.7%），表明细胞被阻滞于S期。SKMES细胞仅显示G₂/M期细胞比例轻度降低（从37.4%降至27.1%）和S期细胞的极有限增加（从0.51%升至3.97%），与其对OLE的耐受性一致。

*3.6 OLE与顺铂的协同促凋亡效应*

HSA模型分析显示，OLE与顺铂联合在GLC-1细胞中具有显著的协同促凋亡效应（HSA评分5.98, p=0.00545），在SKMES细胞中也意外地呈现协同作用（HSA评分6.43, p=0.000232），但在GLC-4和A549细胞中未观察到协同效应。该结果提示协同效应可能与细胞系固有的分子特征相关，而不完全取决于其SCLC或NSCLC的组织学来源。

*3.7 OLE损害NSCLC细胞迁移能力*

划痕试验显示，200 μM OLE显著降低了SKMES、A549和CALU-6细胞的集体迁移速率，SKMES细胞从2.4 μm/小时降至1.2 μm/小时，A549从6.5 μm/小时降至4.9 μm/小时，CALU-6从6.1 μm/小时降至3.3 μm/小时。GLC-1和GLC-4的迁移和侵袭能力几乎检测不到，OLE处理无显著影响。

**讨论总结与研究结论**

本研究表明OLE通过调节细胞增殖、凋亡、迁移和应激适应相关的多条信号通路对人肺癌细胞发挥显著的抗肿瘤活性，且SCLC细胞的敏感性高于NSCLC细胞。GLC-1细胞中，OLE触发了以p27^Kip1上调、RAD17和CHK2激活、HSP-32和HSP-60诱导为特征的多层面应激应答，最终导致caspase级联活化和细胞凋亡。相比之下，SKMES细胞通过上调过氧化氢酶、clusterin、cIAP-2和Bcl-xL，以及激活STAT3、ERK1/2和eNOS等促存活信号通路，有效抵抗了OLE诱导的凋亡。值得注意的是，即使在SKMES这种耐药细胞系中，OLE仍能显著抑制细胞迁移，且OLE与顺铂在GLC-1和SKMES细胞中均表现出协同促凋亡效应。尽管OLE的生物利用度有限（橄榄苦苷和羟基酪醇血浆峰值出现在摄入后20–75分钟），但在联合用药中即使最低剂量也显示协同效应，未来可探索纳米颗粒、脂质体等药物递送系统以克服这一限制。

**研究结论：** 本研究确定OLE是一种多效性调节剂，敏感和耐受细胞系之间的差异性应答共同贡献于其效应。在SCLC模型中，OLE影响了细胞增殖、凋亡和应激应答通路。体外观察到的OLE增强顺铂诱导凋亡的作用支持其作为化疗潜在辅助手段值得进一步研究，该效应可能与肺癌细胞固有的分子特征相关，而不取决于其组织学分类。尽管OLE作为一种营养保健品已有既定的使用历史并被美国FDA认定为GRAS（Generally Recognized as Safe），但这些发现应在现有体外研究的局限性内解读。需要进一步在适当的体内临床前模型中开展研究，以确定所观察到的效应能否在体内重现，并表征OLE的药代动力学及其与化疗药物的潜在相互作用，方能在考虑任何临床应用之前评估OLE是否可作为化疗的膳食辅助手段。