基于培养法的波兰东部养殖与自由放养雉鸡（Phasianus colchicus）中弯曲菌属检测：肠道与可食用组织样品中的分布及PCR与MALDI-TOF MS物种鉴定

《Foods》：Culture-Based Detection of Campylobacter spp. in Farmed and Free-Ranging Common Pheasants (Phasianus colchicus) from Eastern Poland: Distribution in Intestinal and Edible Tissue Samples and Species Identification by PCR and MALDI-TOF MS

　　

弯曲菌属（Campylobacter spp.）是重要的食源性病原体，但关于其在普通雉鸡（Phasianus colchicus）中的发生情况及其在肠道与可食用组织样品间分布的数据仍然有限。本研究旨在比较波兰东部养殖与自由放养雉鸡中弯曲菌属的培养法检出率，并通过多重PCR（multiplex PCR）和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）对回收的分离株进行鉴定。研究人员共检查了154只雉鸡，包括71只养殖雉鸡和83只自由放养雉鸡。从每只鸟采集泄殖腔拭子、盲肠内容物、肝脏组织和胸肌样品，共计616份样品。经PCR确认的弯曲菌分离株来自20/71只养殖雉鸡（28.2%），而83只自由放养雉鸡均未获得确认分离株（p < 0.001）。在养殖鸟类中，分离株来自16/71份泄殖腔拭子（22.5%）、7/71份肝脏样品（9.9%）和5/71份胸肌样品（7.0%）；盲肠内容物中未获得分离株。在28个分离株中，23个（82.1%）被鉴定为空肠弯曲菌（C. jejuni），5个（17.9%）被鉴定为结肠弯曲菌（C. coli）。所有分离株的MALDI-TOF MS物种分配结果与多重PCR一致。在所考察的采样期和条件下，从养殖雉鸡中回收到了活菌状态的弯曲菌，包括肝脏和胸肌样品，而从所采样的自由放养雉鸡中未获得确认分离株。由于两组在采样时期、年龄和性别结构以及地理起源上存在差异，观察到的差异不能完全归因于饲养状态。

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一、研究背景与目的

弯曲菌属（Campylobacter spp.）是全球范围内最重要的细菌性食源性病原体之一，其中空肠弯曲菌（Campylobacter jejuni）和结肠弯曲菌（Campylobacter coli）导致了人类弯曲菌病的大多数病例。2024年，弯曲菌病是欧盟报告频率最高的人畜共患病，确诊病例达168,396例。虽然家禽肉被认为是人类暴露的主要媒介，但对包括野禽在内的较少消费禽类物种的贡献仍缺乏全面了解。鸟类是弯曲菌的自然储存宿主，定植个体可能携带高细菌载量而不表现明显临床症状。

普通雉鸡（Phasianus colchicus）既是自由放养的猎禽，也是在农场或围场条件下饲养的物种。雉鸡肉可通过狩猎或专门的野禽生产进入食物链，但其宰杀、运输、去内脏和屠体处理的条件可能不如工业化家禽生产那样标准化。养殖和自由放养雉鸡面临截然不同的管理和生态条件。在养殖种群中，鸟类间的密切接触、共享垫料、饮水和喂食设施以及反复的粪口传播可能促进弯曲菌引入后的快速扩散。而在自由放养鸟类中，携带概率可能受宿主年龄、季节、栖息地利用、社会行为以及与其他鸟类和环境源接触频率的影响。

现有对雉鸡及其他野禽的研究通常集中于肠道携带、粪便样品或特定屠体表面。因此，关于同一只鸟肠道携带、粪便排出与可食用组织中弯曲菌回收之间关系的个体内信息仍然有限。同时，MALDI-TOF MS在雉鸡来源分离株鉴定方面与PCR的一致性的数据也较为匮乏。因此，本研究的目的是比较波兰卢布林地区养殖和自由放养普通雉鸡中弯曲菌属的培养法检出率和基质特异性分布，并评估PCR与MALDI-TOF MS在分离株物种水平鉴定上的一致性。

二、主要关键技术方法

研究人员采用横断面研究设计，对来自波兰东部卢布林地区的154只普通雉鸡进行了检查，其中71只来自三个不同规模的养殖场（年产量分别约500、2000和5000只），83只来自11个狩猎场的自由放养雉鸡。养殖组由40只雌性和31只雄性组成，年龄6-13个月，采样时间为2022年10月至2024年1月；自由放养组由82只雄性和1只雌性组成，年龄估计为5-48个月，采样时间为2022年12月至2023年2月。从每只鸟采集四种样品：泄殖腔拭子、盲肠内容物、肝脏组织和胸肌。样品收集后立即进行选择性增菌培养，采用改良的PN-EN ISO 10272-1:2017程序B，使用Preston肉汤在微需氧条件下于41.5°C孵育48小时，随后在mCCDA琼脂平板上划线分离。对疑似菌落进行氧化酶和过氧化氢酶试验及CHROMagar? Campylobacter显色培养。所有纯化后的疑似分离株通过多重PCR进行物种鉴定，该PCR可区分C. jejuni、C. coli、C. lari、C. upsaliensis和C. fetus subsp. fetus。PCR确认的分离株进一步通过乙醇/甲酸提取法进行蛋白质提取，使用UltrafleXtreme质谱仪和MALDI Biotyper软件进行MALDI-TOF MS分析。统计分析采用Fisher精确检验和Holm校正。

三、研究结果

3.1 PCR确认的弯曲菌属总体发生率

共检查154只普通雉鸡和616份样品。培养法检查获得49个疑似分离株，其中28个经PCR确认为弯曲菌。PCR确认的弯曲菌分离株来自20/71只养殖雉鸡（28.2%），而83只自由放养雉鸡均未获得确认分离株，差异具有统计学显著性（双侧Fisher精确检验，p < 0.001）。在样品层面，养殖雉鸡的284份样品中有28份（9.9%）获得确认分离株，自由放养雉鸡的332份样品中均未获得。

3.2 弯曲菌属的基质特异性分布

养殖雉鸡中，PCR确认分离株从三种样品基质中获得：泄殖腔拭子检出率最高，为16/71只（22.5%）；肝脏组织为7/71只（9.9%）；胸肌组织为5/71只（7.0%）。盲肠内容物中未获得确认分离株。自由放养雉鸡的所有对应基质均未获得确认分离株。经Holm校正后，两组间在泄殖腔拭子（校正p < 0.001）、肝脏组织（校正p = 0.0112）和胸肌组织（校正p = 0.0385）上的差异仍具统计学显著性。阳性鸟来自所有三个养殖场，场别阳性率分别为20.0%、32.0%和30.8%。

3.3 PCR确认弯曲菌分离株的个体水平和物种特异性分布

在20只阳性养殖雉鸡中，13只仅从一个基质获得分离株，6只从两个基质获得，1只从三个基质获得。多重PCR鉴定显示，28个代表性分离株中23个（82.1%）为C. jejuni，5个（17.9%）为C. coli。来自泄殖腔拭子的16个分离株中11个（68.8%）为C. jejuni、5个（31.2%）为C. coli；所有来自肝脏（7个）和胸肌（5个）的分离株均为C. jejuni。C. coli仅从泄殖腔拭子中回收，而C. jejuni从所有三个阳性基质中均有回收。在同一只鸟的不同阳性基质中获得的分离株物种鉴定结果一致，未发现同时携带两种物种的个体。

3.4 MALDI-TOF MS鉴定及与多重PCR的一致性

所有28个PCR确认分离株均进行了MALDI-TOF MS分析。MALDI-TOF MS的物种分配结果与多重PCR完全一致，即23个分离株被鉴定为C. jejuni，5个被鉴定为C. coli。尽管不同技术测量间的置信分数有所变化，但最佳匹配的物种分配与相应PCR鉴定结果一致。

四、讨论与结论总结

讨论部分：本研究发现养殖与自由放养雉鸡在弯曲菌检出率上存在显著差异，养殖雉鸡阳性率为28.2%，而自由放养雉鸡未检出确认分离株。阳性鸟来自所有三个调查农场，表明结果并非单一农场所致。养殖条件下的管理因素如密切接触、共享饮水和喂食器以及暴露于粪便污染的垫料可能促进了弯曲菌的粪口传播。自由放养雉鸡中未检出分离株与先前欧洲研究结果形成对比，这不应被解释为自由放养雉鸡普遍无弯曲菌，而是表征了特定采样期和培养条件下所调查种群的状况。泄殖腔拭子检出率最高而盲肠内容物未检出的意外不一致可能反映了生物学异质性和方法学因素，包括仅从单侧盲肠取1克内容物、弯曲菌在盲肠内的不均匀分布等。从肝脏和胸肌样品中回收活菌弯曲菌对食品安全具有直接意义，但这些发现需要谨慎解释，因为无法确定细菌位于组织内部还是来自屠宰、去内脏过程中的表面污染。物种鉴定结果显示C. jejuni占优势（82.1%），这与芬兰研究相似但与苏格兰研究（C. coli为主）不同，表明物种组成可能因地理和管理条件而异。MALDI-TOF MS与多重PCR在所有分离株上的一致性支持其作为快速补充鉴定方法的实用性。

研究结论翻译：养殖雉鸡生产可能促进弯曲菌的持续存在并增加其向可食用组织转移的可能性。一个关键未解决问题是这些细菌在组织中的存在源于鸟类的定植还是屠体的二次污染。进一步研究应包括对分离株进行全基因组测序和表型抗菌药物敏感性测试，以确定菌株相关性、识别潜在传播途径并评估其作为抗菌素耐药性储存库的意义。