基于bulk RNA-Seq与单细胞RNA-Seq解析原发性前列腺癌细胞及癌症干细胞中的新型转录等位基因

《Biomolecules》：Identification of Novel Transcriptional Alleles in Primary Prostate Cancer Cells and Cancer Stem Cells by Bulk RNA-Seq and Single-Cell RNA-Seq Analyses

　　

遗传改变与前列腺癌的发生和进展密切相关，但前列腺癌及癌症干细胞（cancer stem cells, CSCs）中RNA来源的转录等位基因景观仍知之甚少。为表征癌症相关的转录等位基因，研究人员分析了来自原代人前列腺癌细胞及其配对的、取自同一患者非癌区域的良性上皮细胞的批量与单细胞RNA测序（RNA sequencing, RNA-seq）数据。测序读数使用STAR比对至人类参考基因组（hg38），并使用ANNOVAR对序列变异进行注释。检测到的大多数转录等位基因位于非编码区域，尤其是在3′和5′非翻译区（untranslated regions, UTRs）内，其中以单核苷酸变异（single-nucleotide variants, SNVs）为主，且C>T置换最为常见。癌症与配对良性样本的比较鉴定出223个基因携带癌症相关转录等位基因，这些等位基因在三个独立患者中均被一致检测到。其中7个基因在CSC与非CSC群体间存在差异表达，19个含有非同义等位基因，包括11个被预测可能具有损伤效应。研究人员将ATF6和KDM3A确定为具有潜在功能意义的候选基因。单细胞RNA-seq分析揭示了不同培养条件下检测到的转录等位基因数量和分布的差异，与富含CSC的3D球体相比，2D癌症培养物检测到更多的总等位基因、编码等位基因及非同义等位基因。CSC群体检测到的转录等位基因也少于非CSC群体。这些发现为表征前列腺癌细胞层级内的转录等位基因异质性提供了框架，并确定了可供进一步研究和功能验证的候选CSC相关改变。最后，本研究所采用的癌症–良性配对策略为肿瘤来源癌细胞恶性起源提供了额外的分子证据。

前列腺癌是全球男性常见恶性肿瘤，遗传改变在其发生和进展中起关键作用。尽管大规模基因组研究已揭示BRCA2、ATM、SPOP、FOXA1等基因的复发性改变，但大多数研究依赖DNA水平分析，无法反映肿瘤内活跃转录区域的等位基因信息。RNA测序（RNA-seq）可同时捕获基因表达和转录区域内的序列变异，为识别癌症相关转录等位基因提供互补手段。然而，RNA来源的变异可能源自基因组突变、RNA编辑、等位基因特异性表达、可变剪接或技术伪影，不能直接等同于体细胞突变。此外，临床肿瘤标本常混杂非恶性细胞，如何确认分离的上皮细胞确为肿瘤来源一直是难题。为此，研究人员利用患者自身配对良性组织作为内部对照，结合批量RNA-seq和单细胞RNA-seq（scRNA-seq），系统分析原代前列腺癌细胞及其匹配良性上皮细胞中的转录等位基因图谱，以期识别癌症相关的候选转录等位基因并探索其在癌症干细胞（CSC）与非CSC群体中的分布特征。

研究人员从芝加哥伊利诺伊大学医学中心的前列腺根治术标本中分离原代前列腺癌细胞（PrE-Ca）和匹配良性外周带细胞（PrE-pz），经2D贴壁培养及Matrigel三维（3D）球体培养获得CSC富集群体。对来自三例独立患者的配对样本进行批量RNA-seq，另对同一患者的2D/3D癌症和良性细胞进行scRNA-seq。测序数据经STAR比对至hg38，使用freeBayes进行变异检出，ANNOVAR进行功能注释，并整合dbSNP、gnomAD和REDIPortal数据库过滤种系变异和已知RNA编辑位点。通过癌症与配对良性样本的严格比对，仅保留癌症细胞中独特表达的转录等位基因，随后进行变异分类、功能影响预测（SIFT）及CSC相关差异表达分析。

结果方面，批量RNA-seq显示大多数转录等位基因位于非编码区域，尤其是3′和5′非翻译区；SNV为主要变异类型，C>T置换最常见。跨三例患者一致检出223个基因携带癌症相关转录等位基因，其中19个含非同义变异，11个被预测具有潜在损伤功能，尤其关注到与内质网应激相关的ATF6和雄激素受体调控相关的KDM3A。scRNA-seq分析通过UMAP聚类鉴定出2D培养第4簇和3D球体第5簇为CSC群体。比较发现，2D癌症细胞检测到的总变异数约为3D CSC富集球体的3倍，编码等位基因约8倍，非同义SNV约10倍；且在2D和3D培养条件下，CSC群体的转录等位基因检出数量均低于非CSC群体。223个基因中有7个（CITED2、YOD1、MCM4、HNRNPA2B1、KIF20B、DPYSL2、NR4A1）在CSC与非CSC间差异表达。数据库注释显示，批量RNA-seq中约32%的癌症独特变异与常见SNV重叠，提示可能反映肿瘤中的等位基因特异性表达；scRNA-seq中与RNA编辑位点的重叠比例较高，且A>G置换在非REDIPortal位点占优，提示存在潜在的新型RNA编辑事件。

讨论部分指出，患者匹配的癌症–良性对照设计能有效减少个体间遗传变异的干扰，降低将罕见种系变异误判为肿瘤相关等位基因的风险。UTR区域富集的变异提示转录后调控在前列腺癌中可能具有被低估的作用。CSC中转录等位基因检出减少可能与肿瘤起始细胞更强的DNA损伤应答、更少的累积复制周期或选择性进化压力有关，但需要DNA测序和功能实验验证。研究结论强调，通过整合患者匹配的批量与单细胞RNA-seq，可有效识别癌症相关RNA来源的转录等位基因并描绘其在前列腺癌细胞层级中的分布梯度。共鉴定223个基因携带此类等位基因，多数富集于非编码UTR；其中CITED2、YOD1、MCM4、HNRNPA2B1、KIF20B、DPYSL2、NR4A1、ATF6和KDM3A等与CSC状态或潜在功能损伤相关。CSC群体较非CSC癌细胞呈现更低的转录等位基因检出负担，支持肿瘤维持细胞可能保持较高基因组稳定性的层级模型。该研究属于探索性和假设生成性工作，未来需结合配对DNA测序、更大规模患者队列及候选基因功能验证，以明确这些转录等位基因的基因组来源、生物学意义和治疗价值。