《Molecules》：Modulation of Hepatic Cholesterol-Related Pathways by Ophiocordyceps sinensis and Coenzyme Q10 in a Sequential Gut–Liver In Vitro Model
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肝脏胆固醇处理失调与氧化应激是营养干预的关键靶点。研究人员采用序贯肠-肝体外模型，研究了Ophiocordyceps sinensis（原名Cordyceps sinensis）提取物与辅酶Q10（CoQ10）的联合作用。利用分化的Caco-2/HT29-MT
肝脏胆固醇处理失调与氧化应激是营养干预的关键靶点。研究人员采用序贯肠-肝体外模型，研究了Ophiocordyceps sinensis（原名Cordyceps sinensis）提取物与辅酶Q10（CoQ10）的联合作用。利用分化的Caco-2/HT29-MTX共培养模型评估肠道转运、跨上皮电阻（TEER）和连接组织结构。将所得的基底外侧肠道条件培养基应用于高糖应激的HepG2细胞。联合处理保持了上皮电完整性（TEER > 400 Ω·cm2）和紧密连接蛋白丰度，同时瞬时增加旁细胞荧光素转运（Papp）并增强基底外侧CoQ10回收率（+29%）。在HepG2细胞中，条件培养基降低了超氧化物产生（?38%），并增强了DiI标记的低密度脂蛋白（DiI-LDL）摄取（+26%）和细胞内总胆汁酸含量（+33%）。这些功能结局伴随着蛋白质丰度的协调变化：甾醇调节元件结合蛋白2（SREBP-2）、3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶（HMGR）和前蛋白转化酶枯草溶菌素/kexin 9型（PCSK9）水平降低，同时低密度脂蛋白受体（LDLR）、细胞色素P450家族7亚家族A成员1（CYP7A1）和三磷酸腺苷结合盒转运体A1（ABCA1）表达增加。多索吗啡（dorsomorphin）的药理学抑制提示AMP活化蛋白激酶（AMPK）信号的部分参与，但该机制评估仍属探索性。总体而言，这些发现表明肠道转运、肝脏功能终点和胆固醇相关蛋白丰度存在协调调节。
**研究背景与目的**
肝脏胆固醇稳态失调是心血管代谢疾病的重要病理基础。尽管他汀类药物可有效降低循环低密度脂蛋白（LDL）胆固醇和心血管事件，但长期使用受限于不耐受、依从性差异以及代偿性调节反应，包括氧化应激增加和前蛋白转化酶枯草溶菌素/kexin 9型（PCSK9）上调，后者可能削弱LDL受体（LDLR）介导的胆固醇清除。红曲米（RYR）因含莫纳可林K（一种天然3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶（HMGR）抑制剂）曾被作为他汀类替代品，但因其莫纳可林含量变异、真菌毒素污染风险及他汀样肌肉相关副作用而在欧洲使用受限。因此，寻找不直接抑制HMGR、而能通过互补机制多通路调节肝脏胆固醇稳态的非他汀样策略成为研究热点。食物来源的生物活性化合物，如小檗碱、β-葡聚糖、植物甾醇等，已被证明可调节LDLR表达、胆固醇吸收、炎症信号和脂质处理。在此背景下，药用真菌Ophiocordyceps sinensis（原名Cordyceps sinensis）富含多糖、β-葡聚糖、虫草素等活性成分，具有调节脂质代谢和抗氧化潜力；辅酶Q10（CoQ10）在线粒体电子传递和抗氧化防御中发挥关键作用，但其高亲脂性、低水溶性和相对较低的肠道吸收限制了口服生物利用度。目前缺乏二者联合对肠道转运和肝脏胆固醇相关通路影响的整合研究。因此，本研究采用序贯肠-肝体外模型，模拟肠道上皮转运后再肝脏暴露，验证联合处理经肠道加工后仍能调节高糖应激HepG2细胞的胆固醇代谢。
**研究方法概述**
研究人员首先对Ophiocordyceps sinensis提取物进行化学表征，测定总碳水化合物、β-葡聚糖和虫草素含量。在分化的Caco-2/HT29-MTX共培养模型（21天，9:1比例）上进行剂量-反应实验，选定200 μg/mL Ophiocordyceps sinensis、43 μg/mL CoQ10和8 μg/mL RYRF（Oryza sativa L.提取物，标准化5.2%总莫纳可林）作为后续实验浓度。经6小时肠上皮转运后收集基底外侧条件培养基，直接用于高糖（30 mM D-葡萄糖）HepG2细胞暴露24小时。检测肠屏障完整性（TEER、紧密连接蛋白、荧光素转运）、基底外侧虫草素和CoQ10回收率；肝脏终点包括细胞活性、超氧化物产生、ERK/MAPK激活、胆固醇相关蛋白（HMGR、LDLR、PCSK9、SREBP-2、CYP7A1、ABCA1）及功能（LDL摄取、胆汁酸、胆固醇含量）。用AMPK抑制剂dorsomorphin（Compound C）评估AMPK信号参与。主要细胞实验来自5次独立生物学重复（Western blot为3次），数据以均值±SD表示，采用ANOVA和Pearson相关分析。
**主要结果**
**2.1 化学表征：** 酚-硫酸法测得总碳水化合物含量为53.2 ± 2.3%（w/w）；Congo red法测得总β-1,3/1,6-葡聚糖为43.7 ± 1.5%（w/w）；Aniline Blue法测得β-1,3-葡聚糖为31.8 ± 1.3%（w/w）；RP-HPLC-UV测得虫草素含量为0.47 ± 0.05%（w/w）。
**2.2 剂量-反应评价：** 在Caco-2/HT29-MTX共培养中，200 μg/mL Ophiocordyceps sinensis、43 μg/mL CoQ10和8 μg/mL RYRF在1-6小时内维持细胞代谢活性，被选为后续实验浓度；联合处理采用200 μg/mL Ophiocordyceps sinensis + 43 μg/mL CoQ10。
**2.3 肠道屏障功能与转运：** 联合处理使TEER达到约525 Ω·cm2（高于预设阈值400 Ω·cm2），并显著增加紧密连接蛋白Claudin-1、Occludin和ZO-1的表达；同时瞬时增加荧光素旁细胞转运和Papp值。基底侧回收率显示，联合处理使虫草素从28.7%升至36.2%，CoQ10从2.6%升至3.7%，相对增加约20%和29%。质量平衡分析显示，单独给予CoQ10时总回收率为68.2%，联合处理后升至85.8%，未计算部分从约32%降至约14%。
**2.4 HepG2细胞反应：** 与高糖对照相比，所有处理均增加细胞代谢活性，联合处理最强；联合处理使超氧化物产生降低约38%；ERK/MAPK激活比RYRF和CoQ10衍生组分高约56%，比Ophiocordyceps sinensis衍生组分高约45%。
**2.5 胆固醇合成、含量与LDL摄取：** 联合处理使HMGR水平降低约54%，总细胞内胆固醇降低约57%，细胞内LDL相关胆固醇降低约27.5%，细胞外残留LDL相关胆固醇降低约23%；DiI-LDL摄取增加约26.1%。在LPDS条件下，50倍过量未标记LDL竞争实验表明摄取主要为LDLR介导的特异性内吞。
**2.6 胆固醇分解与流出：** 联合处理使细胞内总胆汁酸含量增加约33%，CYP7A1蛋白水平增加约30.4%，细胞内游离胆固醇增加约1.33倍，ABCA1蛋白水平增加约26.5%。
**2.7 PCSK9-LDLR-SREBP-2调节轴：** 联合处理使细胞外PCSK9水平降低约73.5%，细胞内PCSK9降低约43%，LDLR蛋白水平增加约44%，SREBP-2降低约49%。Pearson相关分析显示，细胞外PCSK9与LDLR/β-actin比值（r = ?0.9431）和DiI-LDL摄取（r = ?0.8878）均呈显著负相关，支持生物学连贯性。
**2.8 AMPK信号参与：** 联合处理使pAMPK/AMPK比值增加约31%；Dorsomorphin预处理部分减弱了联合处理对HMGR、PCSK9和LDL摄取的影响，但LDL摄取仍高于高糖对照，提示AMPK信号部分参与而非唯一机制。
**讨论与结论**
讨论部分指出，经肠上皮转运后的生物可及部分在肝细胞内仍保留可测活性，可能反映多种化合物的互补或协同作用。TEER与荧光素转运的差异可用“pore”和“leak”旁细胞通路的不同调节解释。AMPK信号可能是联合处理调节胆固醇代谢的部分机制，但dorsomorphin缺乏选择性，需谨慎解读。研究局限性包括：细胞系无法完全模拟体内复杂性、未直接测量代谢通量、未表征CoQ10在培养基中的物理状态、以及未评估完整的药代动力学过程。尽管存在上述局限，序贯肠-肝模型为研究肠道转运对下游肝脏代谢的影响提供了有用的实验框架。
结论：该研究表明，Ophiocordyceps sinensis与CoQ10联合应用经序贯肠上皮处理后，可协调改变高糖条件下多个胆固醇相关分子和功能终点，包括HMGR、PCSK9、SREBP-2降低，LDLR、CYP7A1、ABCA1、LDL摄取、细胞内总胆汁酸及AMPK信号升高。这些发现支持进一步临床前研究，但需直接胆固醇通量测量和体内验证以确定因果关系及转化意义。
