结直肠癌肝转移中TIGIT+ CD4+ T细胞富集与较短生存期相关

《Cancers》：TIGIT+ CD4+ T Cell Enrichment in Colorectal Liver Metastases Is Associated with Shorter Survival

　　

背景/目的：结直肠癌肝转移（colorectal cancer liver metastases，CRCLM）的免疫微环境与原发性结直肠肿瘤不同，可能影响免疫治疗的应答。研究人员旨在表征CRCLM中的T细胞亚群和免疫检查点受体表达，并探索其与总体生存期的关联。方法：研究人员对17例接受肝转移灶切除术患者的配对外周血、非肿瘤肝组织和CRCLM标本进行了流式细胞术分析。另有一个包含19例患者的独立队列，采用体外扩增的肿瘤浸润淋巴细胞（tumor-infiltrating lymphocytes，TILs）进行研究。采用Kaplan–Meier/对数秩检验分析，辅以基于二分类和连续变量标记值的Cox模型、中位截断值和置换敏感性分析以及事后临床协变量比较。结果：CRCLM显示CD4⁺ T细胞相对富集和CD8⁺ T细胞减少。在新鲜标本队列中，16例患者（12例死亡）可评估CRCLM中TIGIT⁺ CD4⁺细胞。优化分组显示高表达组与较短生存期相关（HR 5.26，95% CI 1.54–17.94；对数秩p = 0.0036）。中位截断值分析显示相同方向（HR 3.17，95% CI 0.92–11.00；p = 0.0551），连续变量模型也呈现一致趋势（每增加10个百分点，HR 1.69，95% CI 0.82–3.45；p = 0.153）。在扩增队列中，优化分组的高表达与低表达比较HR为17.47（95% CI 3.23–94.59；p < 0.001），连续变量HR方向一致（HR 2.68，95% CI 0.96–7.51；p = 0.060）。优化分组后的低表达组和高表达组之间临床特征均衡。结论：TIGIT⁺ CD4⁺ T细胞富集在CRCLM中显示出与较短生存期的探索性关联，代表了进一步预后和功能研究的有前景的候选指标。独立的扩增队列为这一观察结果提供了补充证据。

**论文解读**

**研究背景与意义**

结直肠癌（colorectal carcinoma，CRC）是全球范围内常见的恶性肿瘤，而结直肠癌肝转移（colorectal cancer liver metastases，CRCLM）是导致CRC患者癌症相关死亡的主要原因。在现代多模式癌症治疗中，免疫检查点抑制剂（immune checkpoint blockade，ICB）的问世标志着癌症治疗的重大突破。然而，相当比例的肿瘤对现有免疫疗法无应答，这常归因于T细胞浸润不足、T细胞耗竭（T cell exhaustion）以及免疫抑制性肿瘤微环境（tumor microenvironment，TME）。在CRC中，检查点抑制剂主要对高微卫星不稳定性（microsatellite instability-high，MSI-H）肿瘤有效。

肝脏是一个耐受性免疫龛（tolerogenic immune niche），其抗原呈递在致耐受条件下进行，可能促进T细胞功能障碍并限制抗肿瘤免疫。这种与原发性肿瘤微环境的差异给开发有效免疫疗法带来了独特挑战。TIGIT（T cell immunoreceptor with Ig and ITIM domains）是免疫检查点家族成员，是新型免疫治疗的有前景的候选靶点。TIGIT主要表达于T细胞和自然杀伤（natural killer，NK）细胞上，与肿瘤细胞上上调的配体CD155（PVR）和CD112（nectin-2）等相互作用，通过共信号传导减弱增殖和细胞毒性。尽管临床前证据充分，但靶向TIGIT的近期临床试验结果参差不齐，凸显了识别TIGIT信号具有生物学相关性的肿瘤特异性免疫环境的必要性。然而，TIGIT在CRCLM中的作用和分布研究甚少，且CD4⁺ T细胞在TME中的作用日益受到关注。因此，针对肿瘤特定免疫浸润特征量身定制ICB方案，有助于提高疗效并减少不良反应。基于此，研究人员开展了本研究，以探索CRCLM的免疫景观特征。

**研究方法概述**

本研究共纳入36例于2019年1月至2021年4月在德累斯顿大学医院接受CRCLM切除术的患者。其中17例患者的T细胞从新鲜CRCLM组织和邻近非肿瘤肝组织中即刻分离，另19例患者的T细胞从切除的肿瘤组织中经体外扩增培养获得。血液样本在外科切除转移灶前即刻采集，新鲜肿瘤和邻近非肿瘤肝组织由经培训的病理科医师从切除标本中获取。

研究采用的主要关键技术方法包括：（1）**流式细胞术（flow cytometry）**：对配对的外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）、非肿瘤肝组织和CRCLM标本进行T细胞亚群及PD-1和TIGIT表达的免疫表型分析，采用统一的顺序圈门策略；（2）**公共RNA测序数据分析**：利用基因表达综合数据库（Gene Expression Omnibus，GEO）中的公开数据集GSE207194，包含36例CRCLM和24例配对的原发性CRC的批量RNA测序数据，用于分析TIGIT基因表达水平和耗竭T细胞基因特征评分；（3）**T细胞体外扩增（ex vivo expansion）**：将肝组织和CRCLM组织切成1 mm3小块，在含200 IU/mL IL-2的RPMI-1640完全培养基中培养，待T细胞生长可见后获取单细胞悬液进行流式染色分析。

**主要研究结果**

**（一）CRCLM中CD4⁺/CD8⁺ T细胞比值逆转显示CD4⁺ T细胞占优势**

通过对17例患者配对的外周血、非肿瘤肝组织和CRCLM病灶进行流式细胞术分析，研究人员发现CD4⁺ T细胞在外周血中占T细胞主导地位，但在非肿瘤肝组织中比例显著下降，而在CRCLM中相比非肿瘤肝组织又显著增加。CD8⁺ T细胞呈相反分布，在非肿瘤肝组织中最为丰富，导致该处CD4⁺与CD8⁺ T细胞比值降低。在CRCLM病灶中该比值再次倒置，CD4⁺ T细胞显著增加而CD8⁺ T细胞减少，表明TME内转向CD4⁺ T细胞占优势。公共RNA测序数据分析进一步佐证，配对原发CRC和CRCLM中CD4和CD8表达水平在CRCLM中均升高，但CD4升高更显著，凸显了CD4优势。

**（二）PD-1在CRCLM中CD4⁺ T细胞上表达增加但与患者生存期无关联**

研究人员分析了配对标本中抑制性受体PD-1的表达。结果显示，非肿瘤肝微环境即足以诱导CD4⁺和CD8⁺ T细胞上PD-1表达相比血液显著增加。在CRCLM中，PD-1⁺ CD4⁺ T细胞相比非肿瘤肝组织进一步显著增加，而CD8⁺ T细胞上PD-1表达在肿瘤组织中未显著增加。然而，Kaplan–Meier生存分析采用优化截断值比较CRCLM中CD4⁺和CD8⁺ T细胞上PD-1高表达与低表达患者，两个亚群均未观察到总体生存期的显著差异。在血液和非肿瘤肝组织中同样未检测到生存差异，中位截断值分析结果亦未改变，表明在该队列中PD-1表达单独与结局无可检测的关联。

**（三）CRCLM中TIGIT⁺ CD4⁺ T细胞富集显示与较短生存期的探索性关联**

公共RNA测序数据分析显示，CRCLM中TIGIT转录本水平相比配对原发CRC显著上调，且TIGIT表达与原发CRC和CRCLM中的耗竭T细胞基因特征均呈强相关性。流式细胞术验证表明，CD4⁺ T细胞上TIGIT表达在血液与非肿瘤肝组织间无显著差异，但在CRCLM中相比肝组织显著增高；而表达TIGIT的CD8⁺ T细胞在肝组织和肿瘤组织中相比血液均显著降低。优化截断值（16.3%）分析显示，CRCLM中TIGIT⁺ CD4⁺ T细胞高表达组与较短生存期显著相关（HR 5.26，95% CI 1.54–17.94；对数秩p = 0.0036），10,000次置换分析p = 0.0339。中位截断值分析呈相同方向但效应减弱（HR 3.17，p = 0.0551）。连续变量Cox模型中，TIGIT⁺ CD4⁺频率每增加10个百分点对应HR 1.69（p = 0.153）。TIGIT在CD8⁺ T细胞上的表达与生存期无关联。进一步分析显示，CD8⁺ T细胞中TIGIT与PD-1呈强相关性，支持该亚群中耗竭标志物的共调控和共表达；而CD4⁺ T细胞中TIGIT与PD-1相关性较弱，提示CRCLM中TIGIT⁺ CD4⁺ T细胞可能反映独特的生物学特征，并非经典耗竭表型。

**（四）体外扩增TILs提供互补的队列水平比较**

在独立队列（n = 19）中，研究人员对CRCLM组织经IL-2驱动体外扩增的TILs进行分析。优化截断值（28.7%）下，TIGIT⁺ CD4⁺高表达组与较短生存期显著相关（HR 17.47，95% CI 3.23–94.59；对数秩p < 0.001），中位截断值分析亦显著（HR 13.90，p = 0.0020）。TIGIT⁺ CD8⁺细胞与生存期无显著关联。连续变量Cox模型显示每增加10个百分点对应HR 2.68（p = 0.060），模型诊断提示关联可能随表达水平和随访时间变化，呈现比均匀线性模型更复杂的模式。直接跨队列比较表明，扩增样本中PD-1⁺ CD4⁺频率与新鲜标本相似，TIGIT⁺ CD4⁺频率中度升高但校正后未达显著性；CD8⁺区室中扩增样本PD-1⁺频率降低而TIGIT⁺频率升高，显示受体和亚群特异性队列差异。

**（五）事后临床协变量敏感性分析**

优化分组后的TIGIT⁺ CD4⁺低表达组与高表达组之间在年龄、性别、原发肿瘤分期、肝切除术前系统治疗史、抗VEGF或抗EGFR治疗、同时性转移、转移灶数目及双叶分布、最大转移灶大小等方面均无名义上的显著差异。在调整肝切除术前系统治疗史的Cox模型中，新鲜队列的优化高对低HR为4.80（95% CI 1.35–17.09，p = 0.015），扩增队列为35.43（95% CI 4.35–288.64，p < 0.001），关联依然保持。

**讨论与结论**

本研究识别出CRCLM中一种独特的免疫表型，其特征为表达TIGIT的CD4⁺ T细胞富集，并在探索性分析中显示与较短生存期相关。CRCLM中CD8⁺ T细胞比例减少可能与肝脏特异性免疫机制有关，如肝窦内皮细胞（liver sinusoidal endothelial cells，LSECs）通过MHC I类分子交叉呈递抗原诱导CD8⁺ T细胞耐受，以及肝内髓系细胞通过Fas–FasL相互作用清除活化肿瘤反应性T细胞。值得关注的是，TIGIT⁺ CD4⁺ T细胞与PD-1共表达较弱，提示TIGIT标记的可能是一条独特的调控通路而非简单反映PD-1介导的经典耗竭。TIGIT⁺ CD4⁺细胞的身份尚需明确，可能代表调节性T细胞（regulatory T cells，Tregs），亦可能为其他CD4⁺功能亚群，需未来结合细胞内FOXP3、效应分子检测或单细胞转录组学加以界定。本研究应以探索性设计来解读，样本量有限导致部分效应估计的置信区间较宽，优化截断值在同一数据集中选取并辅以多种敏感性分析，生存关联应视为假设生成性发现。

研究结论：总之，表达TIGIT的CD4⁺ T细胞在结直肠癌肝转移中富集，且在探索性二分类分析中较高频率与较短生存期相关，连续变量估计方向一致。这些发现突出了转移灶中位点特异性的免疫调控，并将TIGIT⁺ CD4⁺ T细胞富集确定为前瞻性生物标志物研究和机制表征的有前景的候选对象。