《Cancers》：A Multiplex RT-QPCR Assay of ONECUT2, EZH2, and BRCA2 for the Detection of Clinically Significant Prostate Cancer in Needle Biopsies
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背景/目的：基于穿刺活检的分子检测如果灵敏、经济且可重复，可以改善前列腺癌（PCa）的诊断和风险分层。研究人员开发了一个精简的、基于生物学信息的基因表达特征组合（ONECUT2、EZH2、BRCA2），用于癌症检测和侵袭性分层。方法：研究人员设计并验证了针对O
背景/目的：基于穿刺活检的分子检测如果灵敏、经济且可重复，可以改善前列腺癌（PCa）的诊断和风险分层。研究人员开发了一个精简的、基于生物学信息的基因表达特征组合（ONECUT2、EZH2、BRCA2），用于癌症检测和侵袭性分层。方法：研究人员设计并验证了针对ONECUT2、EZH2和BRCA2的多重实时RT-qPCR检测。生物标志物的选择由癌症基因组图谱前列腺腺癌（TCGA-PRAD）和基因表达综合（GEO）队列分析指导。该检测应用于来自255例根治性前列腺切除术标本的979个离体穿刺活检核心；机器学习模型（随机森林、AdaBoost、弹性网络）生成了RNA特征。通过受试者工作特征曲线下面积（AUC）评估诊断和预后性能，通过DeLong检验进行模型比较，并通过Kaplan–Meier和Cox比例风险分析评估无生化复发生存期（BCR）。基于样本对的重复性通过组内相关系数（ICC）评估。结果：三基因表达特征（ONECUT2、EZH2和BRCA2）稳健地区分恶性组织和非恶性组织（AUC = 0.91），并在穿刺活检核心内识别临床显著性癌症（Gleason分级组[GG]≥2对比GG 0–1，AUC = 0.89）。然而，对于高级别的患者水平特征（例如，病理GG3–5，AUC = 0.63），其性能有限。相比之下，ONECUT2基因体甲基化显著地区分病理侵袭性（病理GG3–5，AUC = 0.79；侵袭性疾病，AUC = 0.75），并显示出更优的检测稳定性（甲基化ICC 0.58–0.70对比RNA ICC 0.38–0.61）。此外，ONECUT2 DNA甲基化显著地区分无BCR生存期（风险比= 3.90，p = 0.023），而RNA特征显示出中等趋势（风险比= 1.88，p = 0.053）。值得注意的是，将DNA甲基化与三基因表达特征整合（联合模型）显著提高了对不良特征的预测准确性（例如，前列腺外扩展，ΔAUC = 0.20，p = 0.02），与单独的三基因表达特征相比。结论：虽然多重RT-qPCR组合（ONECUT2、EZH2和BRCA2）在核心水平的癌症检测方面表现出色，但缺乏侵袭性分类的分辨率。相比之下，ONECUT2 DNA甲基化提供了更优的分析可重复性、稳健的癌症侵袭性分层和长期复发风险估计。这些发现表明，将转录和表观遗传标志物整合到多模态框架中，可以提供互补信息，以完善PCa的风险分层。
**研究背景与问题**
前列腺癌（prostate cancer, PCa）是男性中发病率最高的恶性肿瘤，也是癌症相关死亡的第二大原因。其临床行为高度异质，从惰性肿瘤到侵袭性致死表型。传统的临床病理参数，如前列腺特异性抗原（prostate-specific antigen, PSA）和Gleason分级组（Gleason Grade Group, GG），虽仍是风险分层的基石，但常常无法反映肿瘤潜在的分子复杂性，导致低危疾病过度治疗或侵袭性变异体治疗不足。PCa表现出显著的遗传和表观遗传异质性，尽管液体活检等新方法取得进展，但多数检测缺乏肿瘤定位的空间信息；相反，前列腺穿刺活检能提供肿瘤特异性分子特征和解剖背景，仍是临床实践中不可或缺的手段。然而，专门针对穿刺活检设计的实用分子标志物仍不成熟，迫切需要高灵敏度、经济高效且可重复的检测方法。
**研究目的与总体结论**
为应对上述挑战，研究人员通过整合癌症基因组图谱前列腺腺癌（The Cancer Genome Atlas Prostate Adenocarcinoma, TCGA-PRAD）和基因表达综合（Gene Expression Omnibus, GEO）多个公共队列的生物信息学筛选，选择ONECUT2、EZH2和BRCA2三个生物学非冗余且具有治疗可操作性的驱动基因，设计并验证了一种简化的多重实时逆转录-定量PCR（reverse transcription-quantitative PCR, RT-qPCR）检测。该检测被应用于979个离体穿刺活检核心（来自255例根治性前列腺切除术标本），结合机器学习模型生成三基因表达特征。结果发现，三基因表达特征在核心水平的癌症检测和临床显著癌症识别中表现优异，但对患者水平高级病理特征的区分能力有限；相反，ONECUT2基因体DNA甲基化在侵袭性分层、检测稳定性和长期复发风险预测方面更优，将两者整合可显著提高不良特征的预测准确性。这提示转录与表观遗传标志物的互补整合有助于完善PCa的精准风险分层。
**关键方法概述**
研究样本来源于TCGA-PRAD和五个独立GEO数据集（GSE3325、GSE6919、GSE21034、GSE35988、GSE32269），以及一个前瞻性收集的离体穿刺活检队列（2019年4月至2025年2月，979个核心来自255例患者；其中261个样本来自80例患者用于DNA甲基化分析）。主要技术包括：针对ONECUT2、EZH2、BRCA2和内参基因HPRT1的多重RT-qPCR（引物跨外显子连接，四种荧光标记）；随机森林、AdaBoost和弹性网络三种机器学习算法结合10折交叉验证；用受试者工作特征曲线下面积（area under the receiver operating characteristic curve, AUC）、DeLong检验、Kaplan–Meier曲线、Cox比例风险回归和组内相关系数（intraclass correlation coefficient, ICC）评估模型性能与重复性。
**研究结果**
1. **基于TCGA-PRAD数据集分析选择靶基因**：通过文献筛选出16个候选驱动基因，在TCGA-PRAD中系统分析其在恶性组织中的差异表达、与病理T分期和分级组的关联及总生存期相关性。结果显示EZH2与晚期病理T分期和高级别GG相关性最强，ONECUT2和BRCA2在局晚期和高级别肿瘤中也显著上调。基于生物学非冗余性和治疗可操作性，最终选择ONECUT2（调控谱系可塑性和神经内分泌分化）、EZH2（表观遗传重编程）和BRCA2（同源重组修复缺陷）组成三基因组合。
2. **ONECUT2、EZH2和BRCA2 mRNA表达与肿瘤侵袭性正相关**：在TCGA-PRAD队列中，三基因高表达总数可显著分层总体生存期。在GSE3325、GSE6919、GSE21034、GSE35988和GSE32269数据集中，从良性/正常组织到局限性PCa再到转移性PCa/去势抵抗性PCa（castration-resistant prostate cancer, CRPC），三者mRNA表达逐步增加，尤其在转移和CRPC阶段显著升高。
3. **建立多重实时RT-qPCR系统**：设计并验证了ONECUT2、EZH2、BRCA2和HPRT1的引物和探针，计算机分析确认无显著交叉反应；凝胶电泳显示在有模板时无非特异性条带。多重反应与单重反应的扩增曲线和标准曲线相当，表明多重化未损害检测的灵敏度和特异性。
4. **三基因表达特征有效识别恶性组织和临床显著性前列腺癌**：对979个离体穿刺核心的检测数据，机器学习生成的三基因表达特征区分恶性与非恶性组织的AUC为0.91，区分外泌体GG0-1与GG2-5的AUC为0.89，即能较好地识别临床显著性癌症。然而，该特征对患者水平高级病理特征的区分能力有限：病理GG3-5对比GG1-2的AUC为0.63，pT3对比pT2的AUC为0.68，pN1对比pN0的AUC为0.67，侵袭性疾病对比惰性疾病AUC为0.65；对无生化复发生存期仅表现出中等趋势（log-rank p = 0.053，风险比[hazard ratio, HR] = 1.88，95%置信区间[CI]：0.98-3.58）。
5. **ONECUT2基因体甲基化区分侵袭性与惰性特征的潜力**：利用已建立的ONECUT2基因体甲基化数据集（261个样本，80例患者），比较甲基化与RNA特征在患者水平病理终点上的表现。ONECUT2 DNA甲基化区分病理GG3-5对比GG1-2的AUC为0.79，显著高于RNA特征的0.40（p = 0.001）；区分侵袭性对比惰性疾病的AUC为0.75对比0.39（p = 0.003）。高甲基化组患者BCR风险显著升高（log-rank p = 0.023，HR = 3.90，95% CI：1.10-13.82）。将DNA甲基化与三基因表达特征整合的联合模型显著提高了多种不良病理特征的预测准确性，如前列腺外扩展（ΔAUC = 0.20，p = 0.02）、病理GG3-5（ΔAUC = 0.39，p = 0.004）和侵袭性疾病状态（ΔAUC = 0.44，p < 0.001）。
6. **检测重复性和标志物稳定性评估**：在27对重复恶性样本中，ONECUT2 DNA甲基化的ICC（范围0.58-0.70）一致地高于三基因表达特征（范围0.38-0.61）；在弹性网络模型中，DNA甲基化的绝对测量误差显著低于RNA模型（p = 0.034）。表明DNA甲基化检测在穿刺活检样本中具有更好的分析可重复性。
**讨论与结论**
讨论部分指出，三基因表达特征适合核心水平的癌症检测和临床显著癌症的识别，而ONECUT2 DNA甲基化在侵袭性分层和长期复发风险预测方面更具优势。二者整合可形成多模态分子评估框架，有助于指导主动监测、及时干预等临床决策。研究局限性包括样本量受可及性限制、伦理委员会批准的离体活检队列中非恶性核心比例较高、肿瘤异质性及平台差异导致无法在公共数据集中直接进行外部验证等。未来仍需在独立前瞻性队列中使用该特定检测平台进行验证。研究结论可翻译为：研究人员建立了一个稳健、经济的多重RT-qPCR检测，针对ONECUT2、EZH2和BRCA2，在穿刺活检标本中能较好地识别癌症和临床显著性PCa。虽然单独的三基因表达特征对晚期病理特征的预后区分能力有限，但ONECUT2基因体甲基化在可重复性和侵袭性分层方面表现更优。这些发现支持将转录标志物与表观遗传标志物互补整合到分散
