**三株扑草净降解菌的分离鉴定及其合成菌群：降解特性与土壤修复潜力研究**

《Microorganisms》：Isolation, Identification of Three Prometryn-Degrading Strains and Their Synthetic Consortium: Degradation Characteristics and Soil Remediation Potential

　　

扑草净（Prometryn）是一种甲硫基-s-三嗪类除草剂，长期施用后在农业土壤中广泛残留，导致作物药害和潜在的人体健康风险，而微生物降解为修复提供了一种环境友好且经济高效的策略。在本研究中，研究人员从中国哈尔滨长期受污染的玉米田土壤中分离出三株扑草净降解菌，基于形态学、生理生化及16S rDNA序列分析，分别鉴定为假单胞菌属（Pseudomonas sp.）ZM-1、无色杆菌属（Achromobacter sp.）ZM-2和寡养单胞菌属（Stenotrophomonas sp.）ZM-3；据研究人员所知，菌株ZM-3是首个被报道的具有确证扑草净降解能力的纯培养寡养单胞菌属分离株。三株菌在48 h内分别降解了97.3%、85.1%和92.8%的100 mg·L^?1扑草净。1:1:1合成菌群在15 h内去除了96.8%的扑草净，降解效率显著优于单菌，经响应面优化后其12 h降解率达96.87%，半衰期（half-life）为2.2 h。在添加20 mg·kg^?1扑草净的土壤微宇宙（soil microcosm）中，该菌群将污染物半衰期从58.2天缩短至7.8天，30天后去除率达96.3%，同时提高了土壤脱氢酶（dehydrogenase）、过氧化氢酶（catalase）和脲酶（urease）活性。高通量16S rRNA基因测序揭示了修复过程中土壤细菌群落的定向演替、核心降解类群的富集，以及外源物质生物降解途径的预测性富集。玉米盆栽实验证实，该合成菌群在测试浓度下显著缓解了扑草净的植物毒性（phytotoxicity），使植物生长参数恢复至未污染对照的95%–97%。本研究为扑草净污染农业土壤的生物修复提供了一种高效的合成微生物菌群。

## 论文解读：三株扑草净降解菌的分离鉴定及其合成菌群的降解特性与土壤修复潜力

### 一、研究背景与问题提出

扑草净（Prometryn）是一种选择性甲硫基三嗪类（methylthiotriazine）除草剂，通过抑制光系统II（photosystem II）电子传递发挥除草活性，广泛应用于玉米、棉花、水稻和大豆田一年生禾本科杂草及阔叶杂草的防治。然而，其化学稳定性在保证田间药效的同时也导致了长期的环境持久性：扑草净在土壤中的半衰期（half-life）可达274–361天，在淡水中为28天，在海水中为55–75天。中国东北主要玉米产区的田间调查显示，长期反复施用已导致农业土壤中扑草净广泛残留，典型玉米种植区检出率超过40%，并伴随轮作作物药害和地下水淋溶风险。此外，扑草净被认定为内分泌干扰物（endocrine disruptor），即使在环境相关浓度下也能诱导非靶标水生和土壤生物的氧化应激。美国环境保护署（United States Environmental Protection Agency）将其列为潜在致癌物，欧盟于2004年禁用。

微生物降解为除草剂残留去除提供了一种经济高效且生态可持续的途径。已有若干扑草净降解菌被报道能以该除草剂为碳源、氮源或能源，并将其酶促转化为低毒或无毒代谢产物。然而，大多数相关研究集中于纯培养，单菌株因环境适应性窄，在实际应用中存在固有限制：其降解活性受土壤温度、pH、湿度、养分有效性和土着微生物竞争的强烈影响，常导致定殖效率低下，难以在复杂土壤基质中快速建立功能性降解种群，且降解途径常不完整，可能造成有毒中间产物积累和二次污染。此外，扑草净在农业土壤中常与其他除草剂（如乙草胺acetochlor）共存的复合污染也显着抑制了扑草净降解。这些观察结果共同表明，单菌策略在实际复杂土壤修复中存在严重局限。

合成微生物菌群（synthetic microbial consortium）代表了一种有前景的替代策略：组装具有互补代谢能力的菌株可实现代谢分工（metabolic division of labor）和协同效应，从而提升降解效率、拓宽环境适应性并增强系统稳健性。然而，当前仍存在三个关键知识缺口：第一，大多数现有研究聚焦于单菌分离株；第二，迄今尚无由假单胞菌属（Pseudomonas）、无色杆菌属（Achromobacter）和寡养单胞菌属（Stenotrophomonas）构建的扑草净降解合成菌群的报道，且纯培养寡养单胞菌属扑草净降解菌此前未见报道；第三，关于扑草净降解菌群的研究大多局限于液相降解实验，鲜有系统评价其在土壤基质中的修复效率、土壤生态功能恢复和作物药害缓解效果。为填补上述空白，研究人员开展了本研究。

### 二、主要技术方法

研究人员从中国哈尔滨张家村具有五年扑草净施用历史的玉米田表层土壤（0–20 cm）采集污染样品，以扑草净为唯一碳源的基础盐培养基（basal salt medium, BSM）进行富集培养，经梯度稀释涂布和反复划线纯化获得单菌落。通过高效液相色谱（HPLC）筛选高效降解菌，获得三株菌株ZM-1、ZM-2和ZM-3。通过形态学观察、革兰氏染色、生理生化测定以及16S rRNA基因测序和系统发育分析进行菌种鉴定（引物27F/1492R，GenBank登录号分别为PV643981、PV643982和PZ433558）。采用单因素实验评价温度（20–40 °C）、初始pH（4.0–12.0）和接种量（1%–9%）对菌株生长和降解性能的影响。以等体积比1:1:1构建合成菌群，采用Box–Behnken设计（Box–Behnken design, BBD）的响应面法（response surface methodology, RSM）优化降解条件。利用人工污染清洁土壤（20 mg·kg^?1扑草净）进行土壤微宇宙修复实验，测定降解动力学和土壤酶活性；通过Illumina MiSeq PE300平台对16S rRNA基因V3–V4区进行高通量测序，分析细菌群落结构和功能潜力（PICRUSt2预测）。以玉米（Zea mays L.）盆栽实验（扑草净浓度80 μg·kg^?1）验证合成菌群的解毒效果。

### 三、主要研究结果

#### 3.1 三株扑草净降解菌的分离与鉴定

经富集纯化，获得三株高效扑草净降解菌。菌落形态方面：ZM-1呈乳白色、圆形、光滑、边缘完整；ZM-2呈灰白色、黏液状、凸起；ZM-3呈黄色、不规则、边缘根状。三株菌均为革兰氏阴性（Gram-negative）杆菌。16S rDNA序列分析显示，ZM-1与Pseudomonas monteilii具有99.6%的相似性，ZM-2与Achromobacter xylosoxidans具有99.8%的相似性，ZM-3与Stenotrophomonas maltophilia具有99.5%的相似性。据此，三株菌分别被鉴定为Pseudomonas sp. ZM-1、Achromobacter sp. ZM-2和Stenotrophomonas sp. ZM-3。系统发育树显示ZM-3位于寡养单胞菌属分支内，据研究人员所知，这是首例具有确证扑草净降解能力的纯培养寡养单胞菌属菌株的报道。

#### 3.2 生长特性与降解特性

生长曲线显示：ZM-2生长最快，28 h进入稳定期（OD₆₀₀ = 0.91）；ZM-1在36 h达到峰值（OD₆₀₀ = 0.86）；ZM-3生长较慢但持续时间更长，44 h达到最高OD₆₀₀ = 0.79。降解动力学方面，ZM-1在48 h内降解率为97.3%（k = 0.075 h^?1，半衰期 = 9.2 h）；ZM-2为85.1%（k = 0.040 h^?1，半衰期 = 17.3 h）；ZM-3为92.8%（k = 0.055 h^?1，半衰期 = 12.6 h）。三株菌均能以扑草净为唯一碳源生长。

#### 3.3 环境耐受性比较

三株菌在30 °C和pH 7.0时降解活性最高。菌株ZM-3在20 °C和40 °C条件下仍分别保持58%和55%的降解活性，在pH 5.0和pH 9.0分别维持68.3%和72.5%的降解效率，表现出显着优于ZM-1和ZM-2的宽泛pH和温度耐受性。

#### 3.4 合成菌群的降解条件优化

1:1:1合成菌群在15 h内去除了96.8%的扑草净，显着优于所有单菌株。响应面优化后，最优条件为温度31.73 °C、初始pH 7.28、接种量6.34%，预测12 h降解率为97.01%，验证实验实际值达96.87% ± 0.15%。优化后半衰期由3.0 h缩短至2.2 h，降解速率常数k从0.229提升至0.314 h^?1。方差分析（ANOVA）显示回归模型极显着（F = 219.18, p < 0.0001），决定系数R² = 0.9965，三因素对降解率的影响顺序为：pH (B) > 温度 (A) > 接种量 (C)。

#### 3.5 土壤微宇宙修复

在20 mg·kg^?1扑草净污染土壤中，自然对照半衰期为58.2天，30天去除率仅32.4% ± 2.1%。单菌处理中ZM-3效果最佳，半衰期缩短至9.5天，30天去除率达92.1% ± 1.5%。合成菌群表现最优：半衰期仅7.8天，30天去除率达96.3% ± 1.2%，显着优于任何单菌处理（p < 0.05）。

#### 3.6 土壤酶活性

修复15天后，合成菌群处理组土壤脱氢酶（dehydrogenase）、过氧化氢酶（catalase）和脲酶（urease）活性分别较污染对照提高了2.4倍、1.9倍和2.0倍（p < 0.05），而单菌处理效果明显较弱，表明合成菌群不仅实现了高效扑草净去除，还促进了土壤代谢功能的恢复。

#### 3.7 土壤细菌群落结构与功能潜力动态

α多样性分析显示，接种合成菌群后Shannon、ACE和Chao1指数均呈先显着下降后小幅回升的趋势，第12天仍显着低于第0天基线水平（p < 0.01）。NMDS排序和PERMANOVA分析证实了各时间点细菌群落结构存在显着差异（p < 0.01），呈现明显的定向演替。初始土壤以放线菌门（Actinobacteriota, 48.57%）和绿弯菌门（Chloroflexi, 24.58%）为主；随修复进程，变形菌门（Proteobacteria）和厚壁菌门（Firmicutes）相对丰度逐步升高。属水平上，Pseudomonas、Bacillus和Pseudoxanthomonas等具有污染物降解能力的类群显着富集成为后期优势属。LEfSe分析鉴定出38个LDA评分 > 2.0的阶段特异性生物标志物（biomarker），后期标志物集中于假单胞菌科（Pseudomonadaceae）、芽孢杆菌科（Bacillaceae）和黄单胞菌科（Xanthomonadaceae）。PICRUSt2功能预测显示，外源物质生物降解、能量代谢和膜转运相关功能潜力随修复进程逐渐富集，与扑草净快速降解阶段高度同步。

#### 3.8 玉米解毒实验（盆栽）

在80 μg·kg^?1扑草净污染土壤中，玉米地上部长度、根长、地上部鲜重和根鲜重分别较清洁对照下降63%、66%、76%和55%（p < 0.01）；添加合成菌群后，四项指标恢复至对照的95%–97%，与清洁对照无显着差异（p > 0.05）。菌群处理组土壤扑草净残留量低于方法检出限（0.01 mg·kg^?1），而未接种污染土壤仍残留68 μg·kg^?1。

### 四、讨论与结论

本文首次报道了一株可在纯培养中高效降解扑草净的寡养单胞菌属菌株ZM-3。尽管该属此前在能够降解s-三嗪类除草剂的混合菌群中被检测到，但ZM-3是首个具有确证扑草净降解能力的纯培养分离株。由Pseudomonas sp. ZM-1、Achromobacter sp. ZM-2和Stenotrophomonas sp. ZM-3构建的合成菌群在液相和土壤体系中均表现出显着优于各单菌的降解性能，其增强效应源于三株菌差异生长模式形成的时间生态位互补、差异环境耐受性带来的广泛适应性，以及可能的代谢分工减轻中间产物反馈抑制。高通量测序结果揭示了修复过程中外源降解菌与土着功能菌（如Bacillus和Arthrobacter）的协同富集，这种代谢互补构成了菌群在土壤中优异降解性能的机制基础。PICRUSt2预测的外源物质降解和能量代谢功能富集与增强的酶活性一致，表明菌群通过细菌群落的结构重塑和功能重塑驱动了土壤生态功能改善。玉米盆栽实验证实，在80 μg·kg^?1的环境相关浓度下，合成菌群可将土壤扑草净残留降至检出限以下，使玉米生长恢复至未污染对照水平。

研究结论：本研究从长期除草剂污染农业土壤中分离出三株分别属于假单胞菌属、无色杆菌属和寡养单胞菌属的扑草净降解菌，构建了代谢互补的合成菌群，并在液相培养和土壤基质中系统评价了其修复潜力。菌株ZM-3是首例具有确证扑草净降解能力的纯培养寡养单胞菌属分离株，这一发现拓展了可培养s-三嗪降解菌的已知分类范围，并为降解菌群构建提供了新型耐胁迫菌株资源。三菌群通过代谢互补和生态位分化，在降解效率和环境适应性方面均优于单菌。土壤微宇宙和玉米盆栽实验证明，该菌群实现了高效污染物去除，恢复了土壤生化酶活性，缓解了扑草净植物毒性并恢复了植物生长。最优降解条件与东北玉米田生长季土壤环境参数高度吻合，为扑草净污染农业土壤原位生物修复提供了从菌株筛选到条件优化再到效果验证的完整可行技术框架。该研究也存在若干局限性：所有实验均在实验室控制条件下以人工污染土壤进行，菌群在实际田间条件下的长期原位修复性能和定殖稳定性有待系统验证；详细的分子降解途径和菌株间实际代谢分工尚未经实验确认；1:1:1等体积比为基础配方，需进一步优化菌株比例和细胞固定化策略；微生物组分析的生物学重复有限，相关生态学结论应谨慎解读。未来工作将聚焦于菌群的田间验证、基因组水平的降解机制阐明以及固定化菌剂的开发，以推动该生物修复策略的实际应用。