《Viruses》：Chimeric Zika Viruses Containing xrRNA1 Elements of Divergent Flaviviruses Retain the Ability to Replicate in Vertebrate and Mosquito Cells and Produce Subgenomic Flaviviral RNA
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黄病毒科（Flaviviridae）成员在其3′非翻译区（3′ untranslated region, 3′ UTR）内编码XRN1抗性RNA结构（xrRNAs），该结构可阻滞细胞5′→3′核酸外切酶1（XRN1）的进程，导致亚基因组黄病毒RNA（subge
黄病毒科（Flaviviridae）成员在其3′非翻译区（3′ untranslated region, 3′ UTR）内编码XRN1抗性RNA结构（xrRNAs），该结构可阻滞细胞5′→3′核酸外切酶1（XRN1）的进程，导致亚基因组黄病毒RNA（subgenomic flavivirus RNA, sfRNA）的积累。寨卡病毒（Zika virus, ZIKV）包含两个此类元件，即xrRNA1和xrRNA2，分别产生sfRNA1和sfRNA2。此外，还描述了一种第三种sfRNA种类（sfRNA3）。基于正黄病毒属（Orthoflavivirus）UTR内序列可调节宿主范围的证据，研究人员将ZIKV基因组中的xrRNA1元件替换为来自九个进化上存在差异的黄病毒的xrRNA1或xrRNA1样元件，并评估所得嵌合病毒的体外宿主范围，以确定xrRNA1是否有助于宿主特异性。研究人员选取了蚊媒、蜱媒、昆虫特异性和脊椎动物特异性正黄病毒，以及瘟病毒属（Pestivirus）、丙肝病毒属（Pegivirus）和肝炎病毒属（Hepacivirus）的代表性病毒。所有遗传交换均产生了能在脊椎动物（Vero）和蚊虫（C6/36）细胞中复制的嵌合病毒。野生型ZIKV在Vero细胞中的滴度显著高于所有嵌合病毒，但在C6/36细胞中未表现出一致的复制优势。所有嵌合病毒均产生sfRNA1，而sfRNA2和sfRNA3的检测因替换的xrRNA1序列和宿主细胞类型而异，表明异源xrRNA1替换可以以宿主细胞依赖的方式改变下游sfRNA的产生。总之，将ZIKV xrRNA1元件替换为进化上存在差异的xrRNA1或xrRNA1样序列并未改变体外宿主范围，也未消除sfRNA1的产生，但显著降低了脊椎动物细胞中的病毒适应性。
黄病毒科3′UTR中xrRNA1元件对寨卡病毒宿主范围及亚基因组RNA产生的影响——基于嵌合病毒的系统研究
一、研究背景与目的
黄病毒科（Flaviviridae）包含四个传统属：肝炎病毒属（Hepacivirus）、正黄病毒属（Orthoflavivirus）、丙肝病毒属（Pegivirus）和瘟病毒属（Pestivirus）。其中，正黄病毒属因包含登革病毒、日本脑炎病毒、西尼罗病毒（West Nile virus, WNV）、黄热病病毒和寨卡病毒（Zika virus, ZIKV）等全球重要病原体而具有重大公共卫生意义。正黄病毒可根据宿主范围和传播循环大致分类：蚊媒和蜱媒黄病毒（MBFVs和TBFVs）在节肢动物媒介与脊椎动物宿主间循环传播；昆虫特异性正黄病毒（ISFs）又分为经典ISFs（cISFs）和双宿主相关ISFs（dISFs）；脊椎动物特异性正黄病毒（NKVs）则通过蝙蝠或啮齿动物间直接传播。
黄病毒科病毒的基因组为约9至13 kb的单股正链RNA，包含一个长开放阅读框（ORF），两侧为高度结构化的5′和3′非翻译区（UTRs）。细胞5′→3′核酸外切酶1（XRN1）在真核基因调控中发挥核心作用，可降解缺陷或异常RNA，同时也参与抗病毒防御。然而，越来越多的黄病毒被发现其3′UTR内含有XRN1抗性RNA结构（xrRNAs），可阻滞核酸外切酶进程，导致亚基因组黄病毒RNA（sfRNAs）的积累。sfRNAs可调节宿主抗病毒反应并增强病毒复制和传播。
ZIKV基因组包含xrRNA1和xrRNA2两个xrRNA结构，分别产生sfRNA1和sfRNA2，部分细胞类型中还可检测到第三种sfRNA3。既往研究表明，sfRNA1缺陷型ZIKV在小鼠脑和胎盘中的复制效率低于野生型病毒，在蚊虫细胞中复制效率反而高于野生型，而在人细胞中则较低。此前的嵌合病毒研究已证明黄病毒UTR在宿主特异性中的重要作用，例如ZIKV的5′和3′UTR被dISF相应区域替换后丧失在脊椎动物细胞中的复制能力。然而，UTR内具体哪些RNA结构和序列元件调节宿主特异性仍不清楚。基于xrRNA1在sfRNA产生中的既定作用以及sfRNAs对病毒—宿主互作的影响，研究人员选择xrRNA1作为宿主特异性的候选决定因素进行系统研究。
二、研究内容与主要结论
研究人员将ZIKV基因组中的xrRNA1元件替换为来自九个进化上高度分化的黄病毒科成员的xrRNA1或xrRNA1样元件，包括六种代表性正黄病毒：细胞融合因子病毒（CFAV；cISF）、长松键病毒（LPKV；dISF）、莫多克病毒（MODV；啮齿动物相关NKV）、里奥布拉沃病毒（RBV；蝙蝠相关NKV）、蜱传脑炎病毒（TBEV；TBFV）和WNV（MBFV），以及瘟病毒属的非典型猪瘟病毒（APPV）、丙肝病毒属的GB病毒-A（GBVA）和肝炎病毒属的啮齿动物肝炎病毒（RHV）。所有遗传交换均产生了可在脊椎动物（Vero）和蚊虫（C6/36）细胞中复制的嵌合病毒，表明异源xrRNA1替换未改变体外宿主范围，也未消除sfRNA1的产生。然而，野生型ZIKV在Vero细胞中的复制滴度显著高于所有嵌合病毒，且形成的噬斑显著更大，表明异源xrRNA1替换在脊椎动物细胞中造成了明显的适应性代价。在C6/36细胞中，野生型ZIKV未表现出一致的复制优势，各嵌合病毒间的复制动力学存在差异且随时间变化。sfRNA谱分析显示，xrRNA1替换以序列和宿主细胞依赖的方式影响下游sfRNA2和sfRNA3的检测，表明异源xrRNA1替换的影响不仅限于sfRNA1本身，还可延伸至3′UTR下游区域。
三、主要技术方法
研究使用了以下关键技术方法：利用Gibson组装技术构建含异源xrRNA1元件的ZIKV全长基因组嵌合质粒并转染C6/36细胞拯救重组病毒；通过RT-PCR和Sanger测序验证嵌合病毒基因组中异源xrRNA1元件的正确替换；采用Western blot检测ZIKV prM蛋白表达以确认病毒蛋白产生；通过多步生长曲线和噬斑测定比较野生型与嵌合病毒在Vero和C6/36细胞中的复制动力学和病毒产量；利用Northern blot分析检测各病毒在不同细胞类型中的sfRNA产生谱；运用KnotFold和RNAfold等生物信息学工具预测xrRNA1元件的二级结构并计算拓扑复杂度、最小自由能（MFE）等结构参数。所有病毒均来自单一ZIKV毒株（PRVABC59），细胞系为Vero（非洲绿猴肾细胞）和C6/36（白纹伊蚊细胞）。
四、研究结果
4.1 xrRNA1元件的序列与结构分析
黄病毒xrRNAs根据核苷酸序列和RNA结构差异分为三类：class 1a（MBFVs和dISFs特征）、class 1b（cISFs、pegiviruses、pestiviruses和hepaciviruses）和class 2（TBFVs和NKVs）。LPKV的推定xrRNA1序列通过序列比对新鉴定，其预测二级结构与ZIKV xrRNA1高度相似。所有xrRNA1元件均包含五个预测参与茎环形成的区域（α、β、γ、δ和ε）及三个参与碱基三连体相互作用的核苷酸。
4.2 嵌合病毒构建
通过替换ZIKV基因组中的xrRNA1元件，成功构建了九个嵌合病毒：ZIKV-CFAV(xrRNA1)、ZIKV-LPKV(xrRNA1)、ZIKV-MODV(xrRNA1)、ZIKV-RBV(xrRNA1)、ZIKV-TBEV(xrRNA1)、ZIKV-WNV(xrRNA1)、ZIKV-APPV(xrRNA1)、ZIKV-GBVA(xrRNA1)和ZIKV-RHV(xrRNA1)。所有嵌合病毒均产生感染性病毒，Western blot确认了病毒蛋白在Vero和C6/36细胞中的表达，测序验证未检测到异源xrRNA1元件内的突变。
4.3 体外复制动力学与产量
在Vero细胞中，ZIKV的复制滴度始终高于所有嵌合病毒，差异自感染后第2天起对多数嵌合病毒显著，第3天起对所有嵌合病毒显著并持续至第7天。在C6/36细胞中，ZIKV未表现出一致的复制优势，各病毒间复制动力学差异明显且随时间变化，例如感染后第3天ZIKV滴度显著低于除含RHV和WNV序列外的所有嵌合病毒，但在后期时间点（第5至7天）ZIKV滴度显著高于包括含RHV和WNV序列在内的多个嵌合病毒。
4.4 噬斑形态
在Vero细胞中，ZIKV噬斑平均直径为1.92 ± 0.64 mm，而嵌合病毒噬斑约小3至5倍，范围为0.39 ± 0.23 mm（ZIKV-GBVA(xrRNA1)）至0.75 ± 0.58 mm（ZIKV-RHV(xrRNA1)），所有差异均具有统计学显著性。嵌合病毒间比较显示，ZIKV-RHV(xrRNA1)的噬斑显著大于含APPV、CFAV、GBVA、LPKV、RBV和TBEV元件的嵌合病毒，ZIKV-MODV(xrRNA1)的噬斑显著大于ZIKV-APPV(xrRNA1)。
4.5 sfRNA产生
Northern blot分析显示，在Vero细胞中，野生型ZIKV产生三种sfRNA（sfRNA1约500 nt、sfRNA2约400 nt、sfRNA3约260 nt）。含ISF来源xrRNA1元件的ZIKV-CFAV(xrRNA1)和ZIKV-LPKV(xrRNA1)也产生三种sfRNA，其余嵌合病毒仅检测到sfRNA1和sfRNA2，唯ZIKV-APPV(xrRNA1)仅检测到sfRNA1。在C6/36细胞中，野生型ZIKV仅产生sfRNA1和sfRNA2，ZIKV-RBV(xrRNA1)和ZIKV-APPV(xrRNA1)同样仅产生两种sfRNA，而其余七个嵌合病毒均产生三种sfRNA。sfRNA1:sfRNA2比值方面，野生型ZIKV在Vero和C6/36细胞中分别为0.37和0.50，多数嵌合病毒比值小于1.0，但ZIKV-RBV(xrRNA1)、ZIKV-TBEV(xrRNA1)和ZIKV-RHV(xrRNA1)在Vero细胞中以及ZIKV-MODV(xrRNA1)和ZIKV-APPV(xrRNA1)在C6/36细胞中的比值介于1.09至1.29之间。sfRNA1:sfRNA3比值方面，野生型ZIKV在Vero细胞中为0.54，ZIKV-CFAV(xrRNA1)和ZIKV-LPKV(xrRNA1)分别为1.69和1.52，C6/36细胞中ZIKV-CFAV(xrRNA1)为1.67，其余产生sfRNA3的嵌合病毒比值范围为0.79至1.27。
4.6 xrRNA1元件的预测结构特性
结构预测分析显示，各xrRNA1元件的序列长度范围为81至108 nt，拓扑复杂度范围为1.5至29.0，MFE范围为?34.3至?22.0 kcal/mol，综合结构评分范围为?2.43（CFAV）至2.93（TBEV），表明不同来源的xrRNA1元件在预测的热力学稳定性和结构复杂性方面存在显著差异。
五、讨论与结论
讨论部分指出，虽然所有嵌合病毒均能在脊椎动物和蚊虫细胞中复制，但异源xrRNA1替换影响了病毒适应性。Vero细胞中病毒滴度和噬斑大小的一致性降低提示xrRNA1替换影响了病毒—宿主细胞互作及相关细胞病变效应，但可能反映的是异源xrRNA1元件与周围ZIKV基因组背景的兼容性降低所导致的普遍适应性代价，而非宿主限制。C6/36细胞中复制表型的差异提示异源xrRNA1替换的适应性后果可能具有宿主细胞依赖性。研究存在若干局限性：Vero细胞缺乏I型干扰素产生能力，C6/36细胞缺乏功能性RNAi应答，因此无法评估完整先天免疫应答对表型的影响。嵌合病毒在C6/36细胞中的复制表型与异源xrRNA1的结构类别或供体病毒宿主范围无明显关联，提示表型后果可能取决于替换元件与周围ZIKV基因组之间的序列特异性或背景依赖性互作。所有异源xrRNA1元件均支持在两种细胞类型中产生sfRNA1，表明这些进化上存在差异的元件在ZIKV基因组背景下保留了抵抗XRN1降解的功能。sfRNA谱的多样性表明xrRNA1替换的影响可延伸至3′UTR下游区域，可能通过改变局部或长程RNA互作影响下游RNA结构的折叠、可及性或XRN1抗性。未检测到特定sfRNA种类并不能排除其产量低于Northern blot检测阈值，且sfRNA积累在感染过程中具有动态性。
研究结论为：来自黄病毒科高度分化成员的xrRNA1和xrRNA1样元件可在ZIKV基因组背景下发挥功能，其替换未消除病毒产生。尽管替换天然ZIKV xrRNA1元件显著降低了Vero细胞中的病毒适应性（表现为复制效率降低和噬斑变小），但未消除sfRNA1产生，也未改变相对于亲本ZIKV的体外宿主范围。此前研究已表明整个UTR的替换可深刻改变黄病毒宿主范围，而本研究中所有xrRNA1替换均未改变体外宿主范围，提示在所用实验条件下xrRNA1并非黄病毒宿主特异性的关键决定因素。由于所有实验均在培养细胞中进行，xrRNA1替换对体内病毒适应性、sfRNA产生和宿主特异性的影响仍属未知。未来研究应考察UTR内其他结构元件（单独或组合），包括同时替换xrRNA1和xrRNA2，以进一步阐明黄病毒UTR调节宿主适应和进化的机制。
