杰姆斯敦峡谷病毒通过M片段多位点突变快速适应蚊虫细胞

《Viruses》：Jamestown Canyon Virus Rapidly Adapts to Mosquito Cells Through Multiple M Segment Mutations

　　

摘要专业翻译 杰姆斯敦峡谷病毒（Jamestown Canyon virus, JCV）是一种蚊媒正布尼亚病毒（orthobunyavirus），具有广泛的宿主和媒介范围。尽管蚊媒向人类传播的事件日益增多，但决定宿主适应的病毒因子仍缺乏明确界定。研究人员检测了JCV在蚊虫细胞中连续传代期间的复制变化，并将病毒适应性的适应性变化与特定基因突变相关联。在蚊虫来源的C6/36细胞中，JCV表现出一种独特的“延迟-爆发”（lag-burst）表型，即病毒复制在10天内几乎检测不到，随后突然增加。在重新感染新鲜C6/36细胞后，在蚊虫细胞中传代一次的JCV表现出稳健的复制，且无可检测的延迟期。测序鉴定出与已发表参考序列相比的7个替换，包括Gn中的S193G、3个NSm替换（P346A、M352V和W371R）以及3个Gc替换（H890Y、I1365V和L1394F）。利用基于质粒的反向遗传学（reverse genetics）系统，将单个突变引入重组JCV并检测其对蚊虫细胞复制的影响。所有检测的突变均独立增强了复制效率，表明适应可通过多条独立的遗传途径产生。然而，没有任何单一突变能完全重现通过蚊虫细胞传代自然获得的表型。综上所述，这些发现表明JCV在最小选择压力下可快速适应蚊虫细胞，并突显了日益适应良好的病毒变异株出现的潜在可能。

论文解读

一、研究背景与研究目的

杰姆斯敦峡谷病毒是一种蚊媒正布尼亚病毒，隶属于周布尼亚病毒科（Peribunyaviridae），1961年首次从美国科罗拉多州杰姆斯敦的蚊虫中分离。该病毒广泛分布于美国北部和加拿大，以白尾鹿为主要扩增宿主，同时可在驯鹿、犬、牛、马、狐狸和北极熊等多种偶然宿主中检测到感染证据。血清学研究表明，鹿群中区域血清阳性率超过80%，流行区高达50%的人类存在既往暴露证据，但人类被视为终末宿主。与其他仅限于一种或两种高效蚊媒的虫媒病毒不同，JCV已在至少46种跨越多个属的蚊种中检出，且若干蚊种被认为可维持全年传播。这些观察表明该病毒在生态上分布广泛，宿主关联高度混杂。

然而，JCV仍相对研究不足，即使媒介范围扩大和正布尼亚病毒间已记录的重配现象引发了对新型变异株出现的担忧。该病毒具有由小（S）、中（M）、大（L）三个片段组成的单股负链RNA基因组。S片段编码核衣壳蛋白和非结构蛋白NSs；L片段编码病毒RNA依赖性RNA聚合酶；M片段编码一个糖蛋白前体，经共翻译加工为表面糖蛋白Gn和Gc以及非结构蛋白NSm。Gn和Gc组装为异二聚体形成病毒包膜刺突，Gc被归类为II类融合蛋白。NSm是这些蛋白中特征最不明确的，其功能高度依赖于受感染的宿主。S和M片段编码的蛋白介导病毒进入、膜融合、组装、细胞内运输和先天免疫逃逸，因此直接与宿主细胞机制相互作用，可能是跨越蚊虫和哺乳动物宿主的病毒适应性的主要决定因素。

为研究病毒遗传学如何影响蚊虫和哺乳动物系统中的复制，研究人员比较了两个不同的JCV毒株：JCV/61是1961年科罗拉多州杰姆斯敦的原型分离株，JCV/03是2003年从康涅狄格州混合蚊虫中分离的当代毒株。两株病毒在小、中、大片段上的核苷酸一致性分别为91%、83%和85%，氨基酸一致性因蛋白而异在91%至98%之间。尽管遗传相似度很高，两株病毒在断乳瑞士韦伯斯特小鼠中表现出不同的表型，提示相对有限的遗传差异即可导致可测量的表型变异。

二、研究内容与主要结论

研究人员系统比较了JCV/61和JCV/03在哺乳动物和昆虫细胞系中的复制特性，鉴定出JCV/03在蚊虫来源的白纹伊蚊C6/36细胞中独特的生长表型，发现单次传代即可赋予JCV/03在蚊虫细胞中可遗传的复制增强。通过测序鉴定出少量具有增强复制潜力的替换，并开发了基于质粒的反向遗传学系统实现JCV/03基因组的精确操作。研究揭示了JCV/03基因组中调节复制效率的特定突变以及JCV适应蚊虫细胞的多种遗传途径。这些发现表明JCV在最小选择压力下可快速适应蚊虫细胞，为日益适应良好的病毒变异株的出现提供了警示。

三、关键技术方法

研究人员使用了多种关键技术方法。病毒克隆通过有限稀释法在Vero E6细胞上纯化，利用克隆和PCR结合Oxford Nanopore测序对纯化病毒克隆进行全基因组测序。病毒复制动力学通过多步生长曲线在Vero E6细胞、C6/36细胞和原代大鼠皮层神经元中评估，采用空斑试验和定量PCR（qPCR）定量。为精确定位适应性突变的功能贡献，研究人员构建了基于T7启动子的质粒反向遗传学系统，将JCV/03的S、M、L三个基因组片段克隆至T7驱动质粒中，通过共转染BSR-T7/5细胞拯救重组病毒，并利用PCR定点突变技术引入单个点突变。此外，采用Illumina RNA测序和breseq软件进行变异频率分析，并使用AlphaFold 3进行Gn蛋白三维结构预测。

四、研究结果

JCV/03在蚊虫细胞中表现出蚊虫细胞特异性的复制延迟。 在Vero细胞中，JCV/03和JCV/61表现出相似的复制动力学，JCV/03最终达到更高的峰值滴度。在原代大鼠皮层神经元中，两株病毒最初以相似动力学复制，JCV/03滴度更高，且JCV/61在第3天因神经元死亡而滴度下降，而JCV/03滴度保持相对恒定。相比之下，在C6/36细胞中，JCV/61稳定复制并在感染后约4天达到峰值滴度，而JCV/03在感染后7天内几乎不积累感染性病毒，随后突然过渡到快速复制，最终滴度超过JCV/61。这种“延迟-爆发”模式在两个MOI下均一致，且所有四个纯化克隆和未克隆的亲本株均表现出6至8天的复制延迟后急剧增加，表明该表型是JCV/03的固有特征。

JCV/03延迟-爆发表型反映病毒RNA复制的延迟。 通过匹配的胞外和胞内时间过程实验，研究人员发现JCV/61基因组RNA在培养上清中随时间稳定增加，而JCV/03基因组RNA的释放延迟至第8天后急剧增加。胞内RNA分析显示类似模式：JCV/61基因组RNA早期达到峰值并保持稳定，而JCV/03在最初6天内胞内病毒RNA积累极少，第8天迅速增加至与JCV/61相当的水平。因此，延迟动力学在胞内和胞外均明显，表明延迟期反映病毒复制的延迟而非组装或释放的延迟。

铺板密度调节JCV/03在C6/36细胞中复制的时程和幅度。 在不同细胞密度下感染固定量感染性病毒，JCV/61复制在各条件下保持一致，生长曲线按初始铺板密度分层，但复制动力学无定性变化。相比之下，JCV/03复制受铺板密度强烈影响：增加细胞密度逐步缩短延迟期，且最高密度条件下最早在第6天过渡到指数增长并达到最高峰值滴度，约为同密度下JCV/61峰值滴度的100倍。此外，在缓冲或条件培养基中测试时，HEPES缓冲和条件培养基均可缩短延迟期，但均不足以消除延迟-爆发模式，表明该复制表型主要由病毒内在决定因素驱动。

单次C6/36细胞传代赋予JCV/03可遗传的复制增强。 将亲本JCV/03和JCV/61接种高、低密度C6/36细胞，第12天收集病毒后以等量基因组拷贝感染新鲜C6/36细胞。蚊虫细胞来源的JCV/61表现出适度的复制增强，峰值滴度约为Vero来源病毒的5倍，但整体复制模式不变。相比之下，从高、低密度C6/36培养物收集的JCV/03在感染新鲜C6/36细胞时立即且指数级复制，无可检测延迟，峰值滴度在第6天达到。这表明JCV/03在C6/36细胞中单次传代后即获得可遗传的增强蚊虫细胞复制能力，与初始铺板密度无关。

连续传代揭示JCV/03适应的不同进化轨迹。 两个独立的五次传代系列中，JCV/03先在C6/36细胞中传代两次，再在Vero细胞中传代两次，最后返回C6/36细胞。系列I中，蚊虫细胞来源病毒在新鲜C6/36细胞中无复制延迟，在Vero细胞中复制与亲本一致，但返回C6/36细胞后恢复为原始的延迟-爆发表型。系列II中，蚊虫细胞适应同样消除了延迟期，但伴随在Vero细胞中复制受损，且返回C6/36细胞后适应表型保持稳定。低密度初始适应的病毒在高密度条件下表现出中间表型。这些结果表明蚊虫细胞生长诱导的可遗传变化在哺乳动物细胞传代后可能保持稳定或发生回复。

基于质粒的反向遗传学系统揭示S193G是JCV/03表型所必需的。 测序发现M片段Gn编码区S193G变异在亲本JCV/03库中固定存在，在所有四个纯化克隆中均存在，但不存在于已发表参考基因组中。利用反向遗传学系统构建编码第193位丝氨酸（rJ.03-S）或甘氨酸（rJ.03-G）的重组病毒。rJ.03-G与亲本JCV/03在Vero和C6/36细胞中复制相似，而rJ.03-S在两种细胞中复制均较慢。在C6/36细胞中，rJ.03-S未表现出亲本JCV/03的特征性延迟-爆发表型，而rJ.03-G表现出亲本表型。甘氨酸在该位置跨正布尼亚病毒高度保守，包括JCV/61和所有其他可用JCV分离株。AlphaFold 3结构预测显示S193与G193模型整体结构相似，但G193模型在位置193的局部预测置信度更高。这些结果表明第193位丝氨酸对哺乳动物和昆虫细胞中的复制均不利，且只有编码甘氨酸的JCV/03在蚊虫细胞中表现出延迟-爆发表型。

多个独立M片段突变共同促进C6/36细胞中的复制增强。 连续传代测序鉴定出多个非同义突变，系列I中Gc突变I1365V和L1394F在C6/36细胞传代期间频率增加，在Vero细胞传代后下降；系列II中NSm突变P346A和Gc突变H890Y与C6/36细胞高效复制相关并在Vero传代后持续存在。将每个突变单独引入rJ.03-G后检测其在C6/36细胞中的复制：I1365V在第8天进入快速复制，比Vero来源rJ.03-G提前约两天；L1394F同样在第8天开始增加但峰值滴度仅适度超过对照；P346A和H890Y在第8天前即可检测到复制，随后快速扩增，第10天达到与C6/36来源rJ.03-G相当的峰值滴度。NSm突变W371R在第2天即表现出指数复制，但峰值滴度比亲本低约10倍。NSm突变M352V在约8天延迟期后快速复制，第12天达到峰值，峰值滴度比Vero来源rJ.03-G高十倍以上。所有六个传代相关突变单独引入时均增强C6/36细胞中的复制，但无一能完全重现C6/36来源病毒的快速复制动力学，表明高效适应可能反映多个突变的组合效应。

五、讨论与结论

研究讨论指出，病毒基因型并非影响JCV/03延迟-爆发表型的唯一因素，C6/36培养条件也塑造了感染进程。细胞密度可能通过促进细胞间传播或改变允许性细胞亚群的可及性来缩短延迟期。关于虫媒病毒进化中经典的宿主交替约束理论，研究结果支持一种更细致的观点：宿主交替并非绝对进化屏障，而是作为选择性过滤器，可能有利于与两种宿主兼容的适应性解决方案。第193位甘氨酸很可能代表野生型序列，而参考序列中的丝氨酸可能源于测序错误，这一结论得到多个证据支持：所有可用JCV序列均编码甘氨酸、编码丝氨酸的重组病毒复制不良、编码甘氨酸的重组病毒与亲本复制动力学一致。六个传代相关突变的位置和性质提供了其潜在作用机制的线索：H890Y定位于Gc茎部亚结构域2，L1394F紧邻预测跨膜结构域，位于类似其他病毒融合蛋白的膜近端外部区域，NSm突变P346A和M352V定位于NSm结构域II，W371R定位于结构域III跨膜结构域。研究也存在局限性，包括C6/36细胞缺乏功能性抗病毒RNAi反应、Vero细胞不能产生I型干扰素、培养基pH和温度差异可能构成额外选择压力，以及qPCR定量无法区分感染性颗粒和缺陷性病毒基因组。总体而言，本研究识别了JCV分离株中先前未被认识的蚊虫细胞特异性复制表型，证明JCV可通过M片段内多个独立突变快速适应蚊虫细胞，Gn、Gc和NSm突变增强复制的发现凸显了蚊虫细胞适应可用的遗传途径多样性，为剖析宿主特异性适应性和虫媒病毒进化的病毒决定因素提供了框架。