《Current Oncology》：FGFR2 Fusions in Pancreatobiliary and Ampullary Cancers: High Detection Rate in FFPE Specimens of Intrahepatic Cholangiocarcinoma with Limited RNA Yields Using Amplicon-Based NGS Assay
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成纤维细胞生长因子受体2（FGFR2）融合在约10–16%的肝内胆管癌（iCCA）患者中被检出，属于可靶向治疗的基因变异，已有多种FGFR抑制剂获批用于临床。为评估基于扩增子的下一代测序（NGS）方法在该临床场景下的实用性和检测性能，研究人员使用Oncomin
成纤维细胞生长因子受体2（FGFR2）融合在约10–16%的肝内胆管癌（iCCA）患者中被检出，属于可靶向治疗的基因变异，已有多种FGFR抑制剂获批用于临床。为评估基于扩增子的下一代测序（NGS）方法在该临床场景下的实用性和检测性能，研究人员使用Oncomine Comprehensive Assay Plus（OCA-P）对FGFR2融合检测进行了评估。研究回顾性分析了2023年3月1日至2024年6月30日期间提交进行FGFR2融合检测的75例胆道、胰腺和壶腹部恶性肿瘤福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）样本，其中包括40例iCCA。所有iCCA样本均成功完成分析。FGFR2融合仅在iCCA中被检出，检出率为20%。iCCA样本的RNA浓度范围为0.02 ng/μL至104 ng/μL；其中6例（15%）RNA产量低于1 ng/μL，10例（25%）介于1–2 ng/μL之间。尽管RNA输入量有限，OCA-P仍表现出稳健的检测性能，在低于2 ng/μL的浓度下成功鉴定出FGFR2融合，而该浓度水平通常被认为对伴侣非依赖型NGS方法而言属次优条件。上述发现支持了OCA-P检测在iCCA中实现可靠FGFR2融合检测的稳健性和临床实用性，尤其适用于RNA输入量有限的样本。
**论文解读**
**一、研究背景与科学问题**
胆管癌（cholangiocarcinoma, CCA）是起源于胆道上皮的罕见恶性肿瘤，约占所有胃肠道恶性肿瘤的3%。依据解剖位置，CCA可分为肝内胆管癌（intrahepatic cholangiocarcinoma, iCCA）、肝门部胆管癌（hilar cholangiocarcinoma, hCCA）和远端胆管癌（distal cholangiocarcinoma, dCCA），其中iCCA是仅次于肝细胞癌的第二常见原发性肝脏恶性肿瘤，近数十年来发病率呈上升趋势。iCCA总体预后不佳，尽管小导管型iCCA相比大导管型具有相对较好的生存率，但手术切除仍是唯一可能根治的手段，而大多数患者确诊时已处于不可切除或转移阶段，丧失手术机会。
随着精准肿瘤学的发展，综合基因组分析揭示了iCCA中多种可靶向的基因变异，涉及ARID1A、BAP1、ERBB2、FGFR2、IDH1/2、KRAS和TP53等基因。其中，成纤维细胞生长因子受体2（fibroblast growth factor receptor 2, FGFR2）融合在约10–16%的iCCA病例中被报道，以BICC1为最常见的融合伴侣基因。目前已有多款FGFR抑制剂经临床验证有效并获得监管批准，用于携带FGFR2重排的不可切除或转移性iCCA患者的靶向治疗，因此FGFR2融合检测具有明确的临床治疗指导价值。
然而，FGFR2融合检测面临严峻的技术挑战。目前已报道的FGFR2融合伴侣基因超过100种，其中大多数为罕见或全新的融合伴侣。这种高度的伴侣异质性对检测方法的覆盖度提出了极高要求。当前指南广泛推荐使用伴侣非依赖型（partner-agnostic）RNA-based NGS平台，包括杂交捕获（hybrid-capture）和锚定多重PCR（anchored multiplex PCR, AMP）等方法，其优势在于能够检测未知的新型融合伴侣。但这些方法对RNA质量和起始投入量要求较高，通常需要至少200 ng的高质量RNA输入。在真实世界临床实践中，绝大多数送检样本为来自不可切除或转移性疾病患者的活检标本，这类FFPE样本普遍存在RNA产量低、核酸降解严重的问题，往往难以满足伴侣非依赖型方法的检测条件。相比之下，基于扩增子的NGS检测（amplicon-based NGS）虽然RNA需求量低且对降解核酸的耐受性好，但其仅能检测预定义的融合靶点，覆盖范围有限。因此，如何在真实世界诊断环境中，特别是在RNA输入量严重受限的FFPE活检样本中实现可靠的FGFR2融合检测，成为亟待解决的临床问题。
**二、研究概述与重要意义**
针对上述问题，研究人员系统评估了一种基于扩增子的靶向RNA NGS检测——Oncomine Comprehensive Assay Plus（OCA-P）在iCCA中检测FGFR2融合的性能，重点关注其在低RNA输入FFPE样本中的适用性。该研究回顾性分析了2023年3月1日至2024年6月30日期间提交至Sunnybrook健康科学中心分子诊断实验室的75例FFPE样本，包括40例iCCA（33例活检样本和7例手术样本）。主要发现如下：所有40例iCCA样本均成功完成分析，FGFR2融合仅在iCCA中被检出，检出率为20%（8/40），其中FGFR2::BICC1为最常见的融合伴侣基因（占50%，4/8）。值得注意的是，50%的融合阳性病例RNA浓度低于2 ng/μL，处于伴侣非依赖型平台通常认为的次优范围。1例FGFR2::POC1B融合阳性患者的活检样本RNA浓度仅为1.6 ng/μL，该融合曾被杂交捕获NGS方法漏检，而患者入组靶向临床试验后对FGFR2抑制剂表现出临床应答。Fisher精确检验显示FGFR2融合与iCCA之间存在显著关联（p = 0.01），非iCCA病例中未检出FGFR2融合。该研究的意义在于证明了基于扩增子的NGS方法在真实世界临床条件下对低RNA输入样本的稳健检测能力，为RNA产量或质量不足以进行伴侣非依赖型检测的样本提供了一种实用且临床可行的FGFR2融合检测策略。
**三、关键技术方法**
（1）病例筛选与分类：通过检索NGS数据库，纳入2023年3月1日至2024年6月30日提交FGFR2融合检测的全部FFPE样本，依据病理报告、临床记录和影像学结果确定肿瘤解剖部位。研究经Sunnybrook健康科学中心机构审查委员会批准（REB#5386）。（2）核酸提取与定量：使用Promega Maxwell RSC系统从15张未染色切片（5 μm厚）中宏切割肿瘤区域并提取核酸；RNA采用Quantus平台定量，DNA采用Qubit 4平台定量。标准输入要求为DNA 10 ng、RNA 15 ng；RNA不足时使用最大可用量。（3）靶向NGS检测：DNA变异使用Oncomine Comprehensive Assay v3（OCAv3）检测，RNA融合使用OCA-P检测。文库在Ion Chef系统上以AmpliSeq工作流程制备（DNA为16个循环靶扩增，RNA为26个循环），经自动化模板制备后加载于Ion 540芯片，在Ion S5XL平台上测序。（4）生物信息学分析：使用Ion Reporter软件（5.18版），以hg19为参考基因组，采用扩展过滤链及自定义优化；融合检出要求融合支持读数占总映射融合panel读数≥0.25%且至少200条融合支持读数；同时采用RNA外显子倾斜分析（5′至3′失衡）作为未包含融合伴侣的筛查信号。（5）验证与质控：检测前使用29个含已知融合变异的FFPE样本和SeraSeq Fusion RNA Mix v4商业参考物质进行验证，灵敏度、特异性和阳性预测值均为100%。实验室参与了美国病理学家学会（CAP）和加拿大生物标志物质量保证（CBQA）项目的外部能力验证。
**四、主要研究结果**
**4.1 OCA-P检测验证与外部能力验证（Validation of OCA-P and Participation in External Proficiency Testing）**
正式验证采用每样本15 ng RNA，使用OCA-P工作流程w2.1和Oncomine扩展过滤链。29个预期融合变异（包括ALK、NTRK和ROS1融合等）均被正确检出，无假阴性和假阳性，报告灵敏度、特异性和阳性预测值均为100%。商业参考RNA融合材料在两次运行中的重复测试显示了优异的精密度。在外部能力验证中，实验室正确检出了CAP实体瘤RNA融合调查中全部5个FGFR3融合挑战样本（均获评"Good"等级）。在2024年CBQA FGFR2教育方案中，实验室正确鉴定了FGFR2::SORBS3和两个FGFR2::BICC1样本；对于含FGFR2::STAU2的第四个样本，检测发现了FGFR2表达失衡信号并恰当地提示需进一步检测确认，即四个融合中三个被直接鉴定，第四个生成了筛查阳性失衡信号。
**4.2 OCA-P在肝内胆管癌中的临床评估（Clinical Evaluation of OCA-P on Intrahepatic Cholangiocarcinoma）**
研究队列共75例，其中男性40例（53.3%），女性35例（46.7%），年龄范围41–85岁（中位及平均年龄66岁）。40例（53%）被分类为iCCA，包括33例活检样本和7例手术样本。全部样本（含iCCA）的RNA浓度范围为0.02 ng/μL至104 ng/μL，浓度最低样本对应的测序总RNA输入量仅约0.3 ng。在iCCA中，6例（15%）RNA产量低于1 ng/μL，10例（25%）介于1–2 ng/μL。
在包含614例独特样本（涵盖肺、膀胱、甲状腺和胆道肿瘤）的50个连续OCA-P运行分析中，RNA产量与总映射融合panel读数总体无显著相关性（Spearman ρ = ?0.021, p = 0.6002），仅在记录为零ng/μL的极低浓度时存在关联。RNA浓度<1 ng/μL的样本中位总映射融合panel读数为1,656,850，RNA浓度1–2 ng/μL的样本为1,809,230，而RNA浓度≥2 ng/μL的样本为1,701,517。对于大多数融合，检测限（limit of detection, LOD）为每个反应4–40个拷贝。
全部40例iCCA均通过OCA-P成功完成分析。FGFR2融合在8例中被检出（20%），患者年龄41–72岁（中位52岁），其中男性5例、女性3例。FGFR2::BICC1融合最常见（4/8，50%）。4例FGFR2融合阳性病例的RNA产量低于2 ng/μL。1例FGFR2::POC1B融合阳性患者的肝活检样本RNA浓度为1.6 ng/μL，该患者入组临床试验后对FGFR2抑制剂产生临床应答，而试验中心使用的杂交捕获NGS方法未能检出该融合。Fisher精确检验证实FGFR2融合与iCCA存在显著关联（p = 0.01）。在DNA变异方面，8例FGFR2融合阳性病例中有4例同时检出BAP1变异，与既往文献报道一致。RNA外显子倾斜分析未能检出50%的FGFR2融合阳性病例中的融合信号；但第8号病例通过RNA外显子倾斜初步发现异常，随后经参考实验室杂交捕获方法（UHN CST Panel v1，使用STAR-Fusion和CTAT-SPLICING算法）确认为一种文献中从未报道的新型融合——FGFR2（17）::C1orf50（3）。
**五、讨论总结与研究结论**
讨论部分的核心要点如下：当前指南强调使用伴侣非依赖型RNA-based NGS平台进行FGFR2融合检测，但本研究结果表明，基于扩增子的OCA-P检测在真实世界诊断环境中是一种可行且有效的替代方案。OCA-P在低RNA输入和可能降解的样本中展现出稳健性能——50%的融合阳性病例RNA浓度低于2 ng/μL，且工作流程无需评估RNA完整性（如RIN值），简化了常规实践操作。FGFR2::POC1B融合的临床案例尤为突出地说明，维持对低质量样本的敏感检测策略具有重要临床意义。FGFR2::BICC1融合占本队列检出融合的50%，高于文献报道的25–30%，可能反映了扩增子panel在捕获非经典或罕见融合伴侣方面的固有局限性。关于RNA外显子倾斜分析，该方法的灵敏度不理想（漏检50%的融合阳性病例），但结合CBQA能力验证的经验，在剩余RNA充足时仍建议对阳性外显子倾斜信号进行杂交捕获确认。研究者指出，由于40%的队列样本RNA产量低于杂交捕获方法要求，且其中50%为融合阳性，直接进行两种方法的平行比较不可行且可能导致误导性结论。综上，基于RNA数量和质量的分层检测工作流程——整合扩增子检测和伴侣非依赖型方法——可在灵敏度和资源利用之间取得适当平衡。本研究局限性包括回顾性设计、单中心队列和样本量相对较小。
**研究结论翻译**：基于OCA-P扩增子测序的检测方法能够可靠地检测肝内胆管癌FFPE样本中的FGFR2融合状态。全部40例样本均成功完成分析，FGFR2融合在20%的病例中被检出，其中包括数例RNA产量极低（低于2 ng/μL）的样本。上述结果支持将基于扩增子的测序作为一种实用方法，用于RNA数量或质量可能限制捕获方法使用的样本。然而需要指出的是，用于检测FGFR2融合的确证性外显子倾斜方法亦应予以考虑，但在RNA产量或质量较差的样本中可能面临挑战。本研究的局限性包括为回顾性、单中心队列且样本量相对较小，因此有必要开展更大规模的多中心研究。鉴于FGFR2融合伴侣的广泛多样性、各检测方法设计的局限性以及FFPE活检样本RNA提取的固有困难，整合扩增子检测和融合伴侣非依赖型测序的互补检测策略，可能是在常规临床实践中最大化FGFR2融合临床检出率的有效途径。
