RpS19a缺失重塑造血系统翻译组驱动组织过度生长

《iScience》：RpS19a depletion alters the hematopoietic translatome to drive tissue overgrowth

　　

摘要专业翻译 尽管核糖体蛋白缺失与肿瘤易感性增加相关，但核糖体蛋白耗竭产生这种看似矛盾的致癌效应的直接机制此前尚未见报道。研究人员利用遗传模型研究了果蝇（Drosophila）造血器官——淋巴腺（lymph gland）中核糖体蛋白S19a（RpS19a）的耗竭效应。值得注意的是，研究证明RpS19a耗竭直接驱动细胞过度增殖和组织过度生长。对RpS19a耗竭细胞进行的蛋白质组学（proteomics）和差异翻译（differential translation）分析揭示了翻译起始因子（translation initiation factors）化学计量比的改变，以及核糖体与编码促生长蛋白的mRNA结合增加。此外，RpS19a耗竭细胞中的核糖体与编码dNep1（一种推定的核糖体RNA甲基转移酶）的mRNA相关联。尽管dNep1在果蝇中尚未被表征，但NEP1在酵母和人类中被证实参与核糖体RNA甲基化和核糖体稳定性，其突变是核糖体病鲍恩-孔拉迪综合征（Bowen-Conradi syndrome）的基础。RpS19a敲低（knockdown, KD）表型可被dNep1共耗竭所抑制，这总体表明dNep1能够组装促进增殖的核糖体，而这类核糖体对于核糖体蛋白缺失驱动的血系过度生长至关重要。

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一、研究背景与科学问题

核糖体是细胞内蛋白质合成的核心机器，其生物发生失调与多种疾病密切相关。一方面，癌细胞中核糖体高度富集；另一方面，核糖体功能缺陷是核糖体病（ribosomopathies）的病理基础——这是一类以低增殖相关症状（如生长迟缓和贫血）为主要特征的先天性疾病。然而，核糖体病患者中存在的矛盾性过度增殖表型和显著升高的癌症风险，以及43%的癌症中观察到的核糖体蛋白（ribosomal proteins, RPs）体细胞半合子状态所提示的致癌作用，其机制尚不明确。

以戴蒙德-布莱克凡贫血（Diamond-Blackfan anemia, DBA）为例，该病患者通常表现为造血干细胞和祖细胞（hematopoietic stem and progenitor cells, HSPC）丢失、红系耗竭、骨髓衰竭和贫血，但同时患白血病和多种实体瘤的风险显著升高。DBA中最常见的突变是40S核糖体蛋白RPS19（eS19）的单等位基因缺失（约占确诊患者的25%），其导致HSPC耗竭的机制部分归因于核仁监视通路（nucleolar surveillance pathway, NSP）的激活。然而，DBA患者癌症易感性和恶性肿瘤演化的机制仍不清楚。在果蝇中，某些RP杂合突变导致的组织过度生长是通过组织外在机制发生的，这无法解释为何核糖体功能下降会使患者易患癌症。因此，核心科学问题在于：为什么DBA患者红系祖细胞减少，却患白血病的风险高出28倍？

二、研究内容与总体结论

研究人员通过在果蝇造血 compartment（淋巴腺）中敲低（knockdown, KD）DBA患者最常见突变基因RPS19的果蝇直系同源基因RpS19a，建立了研究模型。研究发现RpS19a KD直接驱动血细胞过度增殖和淋巴腺显著过度生长。对RpS19a KD血系来源S2细胞的多聚核糖体（polysomes）化学计量分析显示，尽管多聚核糖体中RpS19a总体水平降低，但剩余蛋白仍继续与多聚核糖体结合，同时翻译起始因子（eIFs）的化学计量比发生改变。此外，RpS19a KD导致翻译组（translatome）显著失调，包括高度保守的果蝇核仁表达蛋白dNep1（注释为CG3527）翻译增加。定量质谱分析证实RpS19a KD淋巴腺中NEP1蛋白丰度增加。最终，dNep1共KD可抑制RpS19a KD表型，表明增加的dNep1是淋巴腺过度生长所必需的。该研究提供了一个模型：改变翻译可促进过度增殖，从而为RPS19突变DBA患者的癌症易感性提供了直接机制。

三、主要关键技术方法

研究人员使用了以下关键技术方法：利用果蝇遗传模型，通过Hemese-GAL4驱动系统在淋巴腺中进行组织特异性RNAi敲低；采用共聚焦显微镜和三维重建（Imaris软件）进行淋巴腺体积和细胞定量分析；利用EdU标记和磷酸化组蛋白H3（pH3）染色检测细胞增殖；通过RNA测序（RNA-seq）进行转录组分析；采用非靶向定量蛋白质组学（液相色谱-串联质谱，LC-MS/MS）进行蛋白质组分析；利用多聚核糖体图谱分析（polysome profiling）结合RNA-seq和质谱进行差异翻译分析；采用牛津纳米孔直接RNA测序（Oxford Nanopore direct RNA-seq）结合Nanocompore分析检测18S rRNA甲基化修饰变化。样本来源为果蝇幼虫淋巴腺和果蝇S2细胞系。

四、研究结果

RpS19a KD驱动增殖性过度生长并耗竭造血祖细胞

淋巴腺特异性RpS19a KD（由Hemese-GAL4驱动）导致组织过度生长，使用第二条独立UAS-RpS19a RNAi株系也观察到相同表型。敲低另一个DBA常见突变基因RpS24的同源基因同样显著增加淋巴腺体积并耗竭祖细胞，表明该表型并非RpS19a KD特有。RpS19a KD过度生长表型与S期进程和 mitosis 显著增加相关。值得注意的是，尽管HSPC compartment减少，淋巴腺仍发生过度生长。RpS19a耗竭淋巴腺中caspase激活增加，但JNK信号（puc-GFP，NSP的间接指标）降低，表明RpS19a KD相关的细胞死亡不依赖于JNK激活。

RpS19a KD驱动造血分化缺陷

RpS19a KD增加了浆细胞（plasmatocytes，NimC1阳性）数量，但未显著改变晶体细胞（crystal cells，Hindsight阳性）数量。浆细胞适度增加与总体叶体积增加的对比表明，额外细胞群体（如中间祖细胞）的扩增也促进了过度生长。

RpS19a耗竭改变淋巴腺转录组和蛋白质组

RNA-seq差异表达分析鉴定出1,255个差异表达基因（447个上调，808个下调）。基因本体分析显示有丝分裂细胞周期基因富集，包括PCNA、CycA和14-3-3ε等正调控因子上调，而下调转录本富集于分化和发育基因簇。中间祖细胞标志物CG18547转录本丰度增加，浆细胞受体NimC1丰度增加，而晶体细胞标志物lz和PPO1未改变。非靶向定量蛋白质组学鉴定出2,860个蛋白，其中192个蛋白丰度显著改变（136个增加，56个减少），核糖体生物发生和翻译相关蛋白差异显著，包括多种翻译起始因子、延伸因子和核糖体蛋白的增加。

RpS19a KD增加多聚核糖体上翻译起始因子eIF4A和eIF5

多聚核糖体图谱分析显示RpS19a KD后仍能形成80S复合物和多聚核糖体，表明核糖体组装和翻译持续进行。定量蛋白质组学分析显示RpS19a蛋白在细胞裂解液中减少35%，在多聚核糖体中减少48%，与DBA患者报告的水平相当。未观察到相关RpS19b旁系同源物在KD多聚核糖体上代偿性增加。翻译起始因子eIF4A和eIF5在RpS19a KD S2细胞裂解液和多聚核糖体上均增加。eIF4A作为ATP依赖性DEAD box RNA解旋酶，其增加可能促进具有复杂5′非翻译区（5′ UTRs）的特定mRNA解旋，从而改变造血翻译程序；eIF5过表达在人类系统中被证实可促进ATF4原癌基因mRNA的优先翻译。

RpS19a KD导致多聚核糖体上mRNA丰度差异

利用anota2seq进行差异翻译分析，鉴定出324个在输入中未改变但在RpS19a KD多聚核糖体上显著变化的mRNA（161个减少，163个增加），编码细胞周期调控因子（如CycJ）、生长因子（FGF直系同源物Btl）、癌基因（如Ras直系同源物Ras64B）和血系特化因子（如Hemese、crq和bbg）。这表明RpS19a KD在质上改变核糖体组成，在量上改变mRNA物种的翻译选择。

RpS19a KD增加多聚核糖体上dNep1 mRNA丰度

将差异翻译mRNA与淋巴腺中蛋白质显著改变但mRNA水平未改变的基因取交集，仅3个基因重叠：Canopy b、sesB和未表征的CG3527（NEP1的推定直系同源物）。dNep1 KD在S2细胞中导致40S形成减少。RpS19a KD也显著降低40S丰度，而dNep1共KD进一步显著降低40S形成。利用牛津纳米孔单分子长读长测序检测18S rRNA甲基化，Nanocompore双变量模型分析鉴定出36个k-mer位置在对照组和dNep1 KD间存在显著差异，其中仅一个k-mer（5′CUCAA3′）在所有统计检验中均达到显著阈值，该位点位于18S rRNA参考序列第1,279位，对应哺乳动物保守位点第1,248位，与NEP1甲基化共有基序一致。

dNep1是RpS19a KD驱动的淋巴腺过度生长所必需的

dNep1共KD不仅抑制了淋巴腺过度生长，还将干/祖细胞恢复到对照范围。dNep1 KD淋巴腺中ITS1 RNA无显著变化，而RpS19a KD和共KD淋巴腺中ITS1显著增加，表明dNep1 KD导致的40S组装改变可能源于ITS1切割下游的rRNA加工缺陷。研究预测在RpS19a KD淋巴腺中，受损的核糖体生物发生加上dNep1促进RpS19掺入的能力，促进了缺陷核糖体的形成，从而启用增殖性翻译程序。

五、讨论与结论

该研究首次提供证据表明核糖体功能障碍可直接驱动造血谱系过度增殖和血液 compartment 过度生长，提示RP耗竭的继发间接效应并非Dameshek之谜的完整答案。研究发现RpS19a KD破坏了翻译核糖体的化学计量比并改变造血翻译组以驱动增殖性生长。RpS19a KD多聚核糖体上编码癌基因的mRNA增加而肿瘤抑制因子减少，表明核糖体病患者的肿瘤也可能通过促增殖翻译程序产生。缺陷核糖体的形成和相关的差异翻译为克隆优势的获得提供了直接机制，从而促进肿瘤发生。研究还发现eIF4A和eIF5与RpS19a KD多聚核糖体结合增加，这些核糖体选择性决定因子的组成改变可导致翻译保真度改变，进一步促进肿瘤发生。NEP1通过18S rRNA保守假尿苷1,248位点（Ψ1248）的甲基化控制40S成熟，研究预测促增殖翻译组的产生至少部分源于m1Ψ的过量产生。鉴于核糖体生物发生和NEP1在整个真核生物进化中高度保守，这些核糖体改变不仅对理解核糖体病至关重要，也可能为超过43%癌症中RP缺陷相关的恶性肿瘤增加提供新的认识，为针对这些患者的肿瘤新疗法铺平道路。