系统性硬化症过渡性B细胞转录组学特征揭示四种亚群及其异常激活谱

《iScience》：Transcriptomic characterization of transitional B cells reveals four subsets with perturbed activation profiles in scleroderma

　　

研究人员先前证实，硬皮病或系统性硬化症（SSc）患者体内自身反应性过渡性B细胞水平升高，其中包括抗拓扑异构酶I（抗拓扑异构酶I自身抗体[ATA+]）。这表明过渡性B细胞耐受缺陷可能驱动SSc中的自身免疫。为探究此问题，研究人员对未经治疗的SSc患者和健康对照（HCs）分选的过渡性B细胞进行了单细胞转录组学和B细胞受体（BCR）测序。鉴定出四个过渡性B细胞簇：T1、T2、CD27+和边缘区前体（MZPs）。与HCs相比，SSc患者的T1 B细胞显著扩增，增加约2倍。此外，促存活基因（IL4R、TCL1A和S100A10）和干扰素应答基因（IFITM1和IFITM2）在SSc中上调。BCR分析显示，SSc患者互补决定区3（CDR3）疏水性增加，κ/λ比值改变并伴有近端Jκ基因使用倾向。综上，研究结果支持SSc中存在不同的过渡性B细胞发育和激活模式，其中AKT驱动的通路可能促进自身反应性过渡性B细胞的存活。

论文解读文章

一、研究背景与科学问题

系统性硬化症（systemic sclerosis, SSc）是一种以纤维化、血管病变和自身免疫异常为特征的复杂结缔组织病。越来越多的证据表明B细胞在SSc发病机制中发挥核心作用，尤其是临床研究显示针对CD20的利妥昔单抗以及新兴的CD19靶向嵌合抗原受体（CAR）T细胞疗法在部分病例中展现出疗效。B细胞不仅通过分泌抗体和细胞因子协调免疫应答，还可通过呈递自身抗原激活自身反应性T细胞。在SSc中，抗核自身抗体是诊断的核心指标，并可预测器官并发症风险，其中抗拓扑异构酶I自身抗体（ATA）被认为能穿透活细胞核并抑制拓扑异构酶I活性，导致细胞功能紊乱。

研究人员前期发现，SSc患者体内一种名为过渡性B细胞（transitional B cells）的未成熟B细胞亚群具有自身反应性，并在早期发育阶段即产生ATA。这些细胞在健康个体和ATA血清阴性患者中缺失，提示B细胞耐受机制缺陷可能允许ATA⁺ B细胞在SSc中存活。然而，过渡性B细胞在SSc中发生自身反应性转变的具体分子机制尚不明确。既往研究表明，SSc患者过渡性B细胞在BCR交联后抵抗凋亡，从而逃避有效的外周耐受；同时，其BCR的互补决定区3（CDR3）长度增加，而CDR3区域的长度和疏水性与自身结合倾向密切相关。因此，深入解析过渡性B细胞的转录组特征和BCR库，对于阐明SSc自身免疫启动机制具有重要意义。

二、研究目的与意义

本研究旨在利用单细胞转录组学和BCR测序技术，系统表征未经治疗的早期ATA⁺弥漫型SSc患者与健康对照（HCs）的过渡性B细胞，以揭示其亚群组成、转录谱差异和BCR库特征。研究成果将有助于理解过渡性B细胞在SSc自身免疫起始中的作用，并为开发更有效、更耐受的细胞靶向治疗策略提供理论基础。

三、关键技术方法

研究人员从4例早期、未经治疗的ATA⁺弥漫型SSc患者（中位年龄50岁，中位病程9个月）和4例年龄性别匹配的HCs中分离外周血单个核细胞（PBMCs）。采用流式细胞术分选CD19⁺CD24^hiCD38^hi过渡性B细胞群体，随后进行10× Genomics 5'单细胞转录组和VDJ文库构建及Illumina NovaSeq测序。数据经CellRanger比对至GRCh38基因组，通过Scrublet去除双细胞，使用Seurat v4.4进行标准化、整合与聚类分析。BCR序列经Change-O流程处理，利用IgBLAST比对至IMGT种系参考数据库，并通过SCOPer定义克隆。此外，对分选的T1和T2亚群进行批量RNA-seq（bulk RNA-seq）验证。所有SSc患者均来自皇家自由医院风湿病中心，符合2013年ACR/EULAR分类标准。

四、研究结果

1. 过渡性B细胞亚群的鉴定与转录特征

通过单细胞免疫图谱分析，研究人员在CD19⁺CD24^hiCD38^hi细胞中鉴定出五个B细胞簇：T1、T2、CD27⁺、边缘区前体（MZP）和幼稚B细胞。T1/T2/MZP簇高表达AKT共激活因子TCL1A（71%-88%细胞），并呈现显著的核糖体基因特征（占基因表达的33%-39%）。T2细胞较T1细胞上调脂质磷酸酶PLPP5和IGHD；MZP簇表达边缘区相关基因CD9、PLD4和MZB1；CD27⁺簇表达CD27（28%细胞）、金属蛋白酶ADAM28、胞质DNA传感器AIM2等。BAFF受体TNFRSF13C（BAFF-R）表达从T1到MZP再到T2和CD27⁺逐渐增加，而TNFRSF13B（TACI）主要见于CD27⁺簇。免疫球蛋白同种型分布证实多数过渡性B细胞表达IGHD或IGHM，体细胞高频突变（SHM）频率较低（<0.01突变/碱基对）。

2. SSc患者T1 B细胞扩增而CD27⁺细胞减少

配对流式细胞术和scRNA-seq数据显示，SSc患者T1 B细胞比例显著升高，在scRNA-seq中平均占比55.5%（HCs为33.5%），增加约2倍。同时，SSc患者CD27⁺细胞比例在两种数据集中均显著降低。

3. MZP簇与T3细胞及IgM^hi T2细胞的相似性

流式细胞术鉴定的T3细胞在单细胞分析中未被发现，但MZP簇高表达与B细胞无能相关的基因（如CD72、PTPN6、HRK）和边缘区基因，且其比例与流式T3细胞相似。MZP细胞还表现出低IL4R表达和高ITGB7（肠道归巢整合素）表达，提示其可能对应于此前描述的IgM^hi T2细胞。

4. 轨迹分析揭示T1阶段的关键命运决定

Slingshot轨迹推断显示，T1细胞处于三个分化路径的分叉点：一条通向T2-幼稚B细胞（滤泡途径），一条通向MZP（边缘区途径），另一条通向CD27⁺簇。CD27⁺簇富集IgM记忆B细胞和调节性B细胞（Breg）评分，提示T1→CD27⁺轨迹可能代表Breg诱导的新通路。

5. SSc患者CD27⁺亚群中未突变细胞的扩增

CD27⁺簇内存在异质性：高SHM细胞缺乏TCL1A表达，表达肠道归巢和Breg相关基因；低SHM细胞则保留TCL1A等过渡性标记。SSc患者中未突变CD27⁺细胞显著扩增，提示T1来源细胞向该区室的募集增加。

6. SSc患者过渡性B细胞中B细胞激活和存活基因上调

差异基因表达分析显示，SSc过渡性B细胞中AP-1转录因子FOS、干扰素应答基因IFITM1和IFITM2上调，而负调控B细胞激活的基因LYN和BACH2下调。FOXO1及其调控的长链非编码RNA LINC01619在SSc中表达降低，而TNFRSF13C（BAFF-R）在HC中更高。IL4R在SSc CD27⁺簇中上调，KLF2表达降低。此外，氧化磷酸化（OXPHOS）相关基因（如NDUFA4、COX7B、ATP5MF、ATP5F1E）在SSc T1细胞中显著升高。

7. SSc B细胞库中耐受缺陷的证据

SSc患者过渡性B细胞的CDR3区域疏水性氨基酸使用显著增加（尤其在T2簇），芳香族、庞大和极性氨基酸使用减少，CDR3长度略有增加。κ/λ比值在3/4的SSc患者中升高（尤其T1、T2、MZP簇），且高比值患者表现为上游Jκ基因IGKJ1使用增加，提示受体编辑可能不够充分。

五、讨论与结论

本研究通过对早期未经治疗的ATA⁺ SSc患者过渡性B细胞进行单细胞转录组和BCR分析，首次系统描绘了CD19⁺CD24^hiCD38^hi细胞群体中四个过渡性亚群（T1、T2、MZP、CD27⁺）的特征。T1 B细胞在SSc中2倍扩增，提示骨髓早期B细胞调控缺陷，可能包括过早外排、外周耐受受损或脾脏归巢异常。κ/λ比值升高和Jκ基因使用减少进一步支持B细胞提前离开骨髓的假说。

转录组层面，AKT共激活因子TCL1A上调与AKT抑制基因FOXO1下调共同指向增强的AKT信号通路，这可能是促进自身反应性B细胞存活的关键机制。值得注意的是，TCL1A在SSc CD27⁺簇中特异性上调，而近期研究显示TCL1A参与三级淋巴结构形成和B细胞运输，提示其过表达可能推动自身抗体产生。此外，OXPHOS基因的普遍上调反映了自身抗体产生细胞的能量需求增加。

BCR库分析揭示了SSc特有的特征：CDR3疏水性增加增强了自身结合潜力，而κ/λ比值和Jκ基因使用模式的改变暗示中枢耐受（受体编辑）效率下降。这些变化可能在整个B细胞库中持续存在，值得在循环和组织驻留B细胞中进一步探索。

研究局限性包括样本量较小（但均为早期未治疗ATA⁺患者，遗传背景相对均一），未能评估性别影响，以及缺乏疾病受累组织的平行分析。未来需在更大队列中验证这些发现的普适性，并通过功能性实验确认AKT/PI3K通路在自身反应性B细胞存活中的因果作用。

研究结论：本研究通过单细胞转录组学和BCR测序，在SSc患者中鉴定出四个过渡性B细胞亚群（T1、T2、CD27⁺、MZP），发现T1细胞显著扩增，促存活和IFN应答基因上调，BCR库呈现疏水性增加和κ/λ比值改变。这些发现支持SSc中存在异常的过渡性B细胞发育和激活，其中AKT驱动的通路可能促进自身反应性过渡性B细胞的存活，为理解SSc自身免疫起始机制提供了新见解，并提示FOXO1和TCL1A等分子可能成为潜在治疗靶点。