《iScience》：Single nucleus RNA sequencing identifies PLXNA4 upregulation in end-stage arrhythmogenic right ventricular cardiomyopathy
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致心律失常性右室心肌病（arrhythmogenic right ventricular cardiomyopathy, ARVC）是一种罕见的遗传性心脏病，常由桥粒蛋白突变引起。研究人员对11例非衰竭（non-failing, NF）和8例ARVC患者的右心
致心律失常性右室心肌病（arrhythmogenic right ventricular cardiomyopathy, ARVC）是一种罕见的遗传性心脏病，常由桥粒蛋白突变引起。研究人员对11例非衰竭（non-failing, NF）和8例ARVC患者的右心室样本进行了单核RNA测序（single-nucleus RNA sequencing, snRNA-seq），并对139,347个细胞核进行了转录组分析。研究人员在多种细胞类型中鉴定出超过4,400个在NF与ARVC样本之间差异表达的蛋白编码基因。当与扩张型、肥厚型和缺血型心肌病比较时，发现终末期ARVC在转录水平上与其他形式的终末期心力衰竭相似。尽管存在广泛的转录相似性，研究人员仍鉴定出7个心肌细胞基因和6个成纤维细胞基因在ARVC中具有独特的失调表达，并验证了PLXNA4是与其他心肌病相比在ARVC心肌细胞中表达唯一增加的基因。在hiPSC来源的心室心肌细胞中过表达PLXNA4可诱导免疫反应基因表达、抑制钙信号并改变心肌细胞电生理特性，提示PLXNA4可能参与ARVC中的这些通路。
**研究背景与问题**
致心律失常性右室心肌病（ARVC）是一种罕见的家族性致心律失常性心肌病（ACM），全球估计患病率为1:2000–1:5000。其病理特征为早期心外膜右室（RV）心律失常，随后出现心肌细胞死亡、炎症，以及心肌细胞被纤维脂肪组织替代。约50%的ARVC病例由桥粒蛋白的常染色体显性突变引起。尽管具有临床重要性，ARVC的分子起始和进展机制仍不清楚。既往研究认为心律失常和心肌细胞死亡源于闰盘结构破坏，导致黏附丧失和心肌细胞脱离；随后发生炎症和纤维脂肪浸润，可能通过抑制经典Wnt信号通路和激活GSK3b实现。近期在终末期ARVC患者左、右心室组织中的研究表明，TNMD+成纤维细胞和CCL3+促炎巨噬细胞也可能参与右室终末期病变。然而，目前缺乏对ARVC右心室在单细胞水平的系统性转录组解析，尤其是与其他心肌病的差异比较。
**研究目的与设计**
研究人员对11例非衰竭（NF）供体对照和8例ARVC患者移植心脏的右心室游离壁样本进行单核RNA测序（snRNA-seq），经严格质控后保留139,347个细胞核，鉴定出13种细胞类型。通过亚聚类分析、差异表达基因（DEG）鉴定、通路富集以及将ARVC数据与既往发表的肥厚型（HCM）、扩张型（DCM）和缺血型（ICM）心肌病左心室snRNA-seq数据整合（共831,720个细胞核），比较ARVC与其他心肌病的转录特征，并筛选ARVC特异性失调基因。随后在人类组织、人诱导多能干细胞来源的心室心肌细胞（hiPSC-CM）中验证PLXNA4的表达、定位及功能。
**主要方法与技术**
（1）单核RNA测序（snRNA-seq）：从冷冻右室组织提取细胞核，使用10x Genomics Chromium 3′ v3.1平台建库，CellRanger比对至GRCh38 pre-mRNA参考基因组，CellBender去除背景RNA，经严格质控后获得139,347个细胞核。
（2）差异表达与通路分析：采用limma-voom框架进行伪bulk差异表达检验（校正年龄和性别），使用GO:Biological Process、Reactome和KEGG数据库进行通路富集；利用scCODA进行细胞组成分析。
（3）整合多队列分析：将ARVC右室数据与既往发表的左室HCM、DCM、ICM数据整合，通过Harmony校正批次效应，比较各心肌病与各自对照的效应差异，筛选ARVC特异性基因。
（4）免疫荧光与RNAscope：在组织切片上检测Plexin A4、α-肌节辅肌动蛋白、桥粒斑蛋白1/2等蛋白定位，结合DCN和ADIPOQ探针进行原位杂交验证脂肪细胞标志。
（5）hiPSC-CM功能实验：通过慢病毒过表达和siRNA敲降PLXNA4，进行mRNA测序、通路聚类分析及动作电位时程（APD）记录。
（6）临床-组织学关联分析：将PLXNA4表达与年龄、BMI、LVEF、脂肪面积百分比等特征进行关联检验。
**研究结果**
- **终末期ARVC中所有细胞类型发生显著转录变化**：超过4,400个蛋白编码基因在至少一种细胞类型中显著差异表达，其中多个参与脂肪生成和脂质代谢（如ABHD18、ACACB、CBR4等），以及钙信号相关基因（ANO1、ITPR2、CD38等）。通路富集显示成纤维细胞中富集细胞连接组织、ECM组织等通路；心肌细胞富集神经元分化、ECM等；巨噬细胞富集免疫应答通路。
- **脂肪生成标志物仅存在于终末期ARVC的脂肪细胞中**：未观察到心肌细胞或成纤维细胞表达CEBPA；免疫荧光与RNAscope证实CEBPA+细胞为ADIPOQ+脂肪细胞，而非DCN+成纤维细胞。
- **终末期ARVC与其他终末期心肌病共享转录特征**：整合分析显示所有心肌病样本在PCA中与NF分离，但ARVC样本心肌细胞比例减少更为显著，且有脂肪细胞和神经元细胞增加趋势。
- **鉴定ARVC特异性失调基因**：与HCM、DCM、ICM相比，心肌细胞中7个基因（ARHGAP42、FBXO16、SLC6A6、SLCO3A1、RASSF8、PLXNA4上调，TSC22D1下调）和成纤维细胞中6个基因（GLI2、XKR4、GLYATL2、GMDS、COL5A1、PAPSS2上调）具有ARVC特异性改变。
- **PLXNA4在ARVC心肌细胞中特异性增加并定位于闰盘和肌节**：通过免疫荧光验证，Plexin A4在ARVC右室心肌细胞中表达显著升高（Pearson系数r=0.72与桥粒斑蛋白，r=0.59与α-辅肌动蛋白），且在左室其他心肌病中无显著变化；PLXNA4表达与组织脂肪面积呈正相关（p=0.0067），与年龄呈负相关（p=0.0103）。
- **PLXNA4表达与肌动蛋白丝、细胞迁移和黏附通路富集相关**：CS-CORE相关性分析显示，在ARVC中与PLXNA4正相关的通路包括细胞迁移、黏附、肌动蛋白和细胞骨架组分，而NF样本中主要为心脏收缩相关通路。
- **PLXNA4过表达和敲降导致ARVC相关基因及信号通路转录失调**：过表达PLXNA4导致8,375个基因显著变化，包括上调TGFB3、下调RYR2和DSP；敲降则改变DES、JUP、LMNA等基因表达。
- **PLXNA4过表达上调免疫应答通路、下调心脏传导通路并影响心肌细胞电生理**：通路聚类显示下调通路包括细胞周期、心肌发育、ECM组织、心脏收缩和传导；上调通路包括免疫应答、细胞骨架组织和伤口愈合。过表达PLXNA4显著缩短APD75（降低13.0%，p=0.002），增加心律失常易感性。
- **PLXNA4在ARVC小鼠模型中增加，但在hiPSC-CM模型中不增加**：重新分析公开数据发现，DSG2突变hiPSC-CM中PLXNA4表达显著降低，PKP2敲降hiPSC-CM中呈下降趋势；而Pkp2心脏特异性敲除小鼠左室中Plxna4显著上调。
**讨论与结论**
研究人员发现终末期ARVC与其他终末期心肌病共享转录特征，但PLXNA4是心肌细胞中独有的上调基因。PLXNA4（Plexin A4）是一种信号素受体，既往研究显示其参与脑、内皮、肿瘤、免疫细胞迁移等过程。在ARVC中，PLXNA4定位于闰盘和肌节，其表达与脂肪负荷及细胞黏附、肌动蛋白通路正相关，提示其上调可能是一种代偿机制，以增强心肌细胞在纤维脂肪区域的黏附。过表达PLXNA4引起免疫反应基因上调、钙信号和传导基因下调，并缩短APD75，提示其可能参与ARVC的炎症和心律失常表型。但hiPSC-CM模型未能完全重现该现象，说明需要更复杂的疾病模型以阐明PLXNA4的机制。研究局限性包括仅对右室进行snRNA-seq、整合数据存在腔室差异、hiPSC-CM的不成熟性，以及核转录组与整体转录组的比较假设。综上，PLXNA4可能是ARVC的新型治疗靶点或生物标志物，未来研究需在复杂模型中进一步验证其功能。
