苯丙氨酸羟化酶自扩增mRNA-脂质纳米颗粒复合物的构建及其在苯丙酮尿症基因治疗中的剂量节省效应与持续疗效研究

《iScience》：Construction of a self-amplifying mRNA-LNP complex for phenylalanine hydroxylase and its efficacy evaluation in gene therapy for phenylketonuria

　　

苯丙酮尿症（Phenylketonuria, PKU）是一种由苯丙氨酸羟化酶（Phenylalanine Hydroxylase, PAH）活性缺陷引起的常染色体隐性遗传病，目前的药物疗法存在应答率有限和年龄依赖性限制。研究人员在Pah基因敲除（Pah-knockout）小鼠中比较了两种肝靶向脂质纳米颗粒（Lipid Nanoparticle, LNP）制剂——一种递送编码PAH的自扩增mRNA构建体（Self-Amplifying RNA, saRNA），另一种递送常规非复制型mRNA对应物（Non-Replicating mRNA, nr-mRNA）。两种构建体在单次静脉注射后均降低了循环苯丙氨酸（Phenylalanine, Phe）水平。saRNA制剂在六分之一的nr-mRNA剂量下即实现了相当的疗效，并将生理性Phe水平维持了14天，而nr-mRNA仅产生短暂的降低。重复saRNA给药耐受性良好，未检测到免疫原性或肝毒性。这些结果表明，saRNA介导的PAH替代疗法能够以显著降低的剂量提供持续的酶活性，克服了非复制型mRNA疗效短暂的局限。该平台或可为其他需要恢复肝功能的遗传性代谢疾病中的持久酶替代疗法提供更广泛的策略参考。

**论文解读**

**一、研究背景与科学问题**

苯丙酮尿症（Phenylketonuria, PKU）是一种由肝细胞中苯丙氨酸羟化酶（Phenylalanine Hydroxylase, PAH）编码基因突变所致的常染色体隐性遗传性代谢疾病。PAH的功能缺陷导致苯丙氨酸（Phenylalanine, Phe）向酪氨酸（Tyrosine, Tyr）的转化受阻，Phe在血液和脑组织中蓄积，引发不可逆的智力障碍、自闭症谱系障碍、运动功能障碍、色素减退以及特征性鼠尿味等严重临床表现。PKU在高加索裔和东亚人群中发病率约为1:10,000–1:15,000活产儿，遗传异质性显著——PAH基因跨度约90 kb，包含13个外显子，等位基因多样性极为丰富。

新生儿筛查的普及虽显著改善了疾病管理，但现有治疗手段仍面临严峻挑战。终身膳食Phe限制是主流疗法，然而依从性差、难以长期维持。药物干预方面，四氢生物蝶呤（Tetrahydrobiopterin, BH₄）补充疗法仅对部分患者有效，聚乙二醇化苯丙氨酸氨裂合酶（Pegylated Phe Ammonia Lyase）则受限于免疫原性等安全性问题。PAH基因广泛的等位基因多样性使基因编辑等突变特异性策略面临个体化设计复杂、脱靶风险高等临床转化障碍。在此背景下，基于mRNA的蛋白质替代疗法因其突变类型无关性、非整合性瞬时表达和良好的安全性特征，为PKU治疗提供了新的范式。

值得关注的是，2021年BioNTech的BNT162b2 mRNA疫苗获美国食品药品监督管理局（FDA）批准，标志着mRNA技术临床转化的里程碑，推动其从传染病领域加速拓展至肿瘤和代谢性疾病领域。在此基础上，自扩增RNA（Self-Amplifying RNA, saRNA）平台因能在更低剂量下实现强劲且持久的蛋白表达而备受关注。本研究的创新之处在于，将saRNA从预防性疫苗的应用框架中拓展为治疗性蛋白替代工具，以延长PAH蛋白表达、降低给药频率，为PKU这类遗传异质性代谢疾病提供更可持续、更具可扩展性的治疗范式。

**二、研究内容与重要意义**

研究人员构建了两种肝脏靶向的LNP制剂：一种封装编码PAH的saRNA（PAH sa-mRNA-LNP），另一种封装经N¹-甲基假尿苷（m¹Ψ）修饰的非复制型mRNA（PAH nr-mRNA-LNP）。在Pah基因敲除（Pah-KO）纯合子小鼠模型（表现出典型PKU表型：生长发育迟缓、被毛色素减退和高苯丙氨酸血症）中，研究人员系统比较了两种复合物的疗效特征。单次尾静脉注射实验表明，两种制剂均可降低血清Phe，但saRNA制剂在六分之一的nr-mRNA剂量下（10 μg对60 μg）即达到相当疗效，并能将生理性Phe水平维持至给药后42天，而nr-mRNA组在给药后第2天即出现Phe反弹。重复低剂量saRNA给药进一步验证了其良好的耐受性和极低的免疫原性。肝功能指标丙氨酸氨基转移酶（Alanine Aminotransferase, ALT）和天冬氨酸氨基转移酶（Aspartate Aminotransferase, AST）保持稳定，肝脏组织学检查未见明显病理改变。

该研究的意义体现在多个层面：首先，它为saRNA在PKU基因治疗中的临床应用提供了坚实的临床前证据；其次，saRNA-LNP平台在PKU中的成功提示其可拓展应用于酪氨酸血症、尿素循环障碍等其他单基因代谢疾病，且平台模块化设计便于快速适配不同靶基因；再者，显著的剂量节省效应有望降低生产成本和潜在毒性风险，为慢性代谢疾病的长期管理提供了更可行的方案。

**三、关键技术与方法概述**

研究人员采用CRISPR/Cas9技术构建了C57BL/6J遗传背景的Pah-KO基因型小鼠模型，纯合子小鼠表现出经典PKU疾病表型。PAH编码序列基于人类密码子使用偏好进行密码子优化（密码子适应指数经分析验证），saRNA的5′和3′非翻译区（Untranslated Region, UTR）保留委内瑞拉马脑脊髓炎病毒（Venezuelan Equine Encephalomyelitis Virus, VEEV）原始序列，其开放阅读框（Open Reading Frame, ORF）编码VEEV来源的非结构蛋白nsP1–4、26S亚基因组启动子和PAH靶基因；nr-mRNA的5′UTR选自人α-珠蛋白，3′UTR由人线粒体12S rRNA（mtRNR1）和人AES/TLE5基因的两个片段组成，并采用m¹Ψ修饰。两种mRNA均经T7聚合酶体外转录及牛痘病毒加帽酶（Vaccinia Capping Enzyme, VCE）加帽制备。LNP采用SM-102离子化阳离子脂质配方（SM-102:DSPC:胆固醇:PEG 2000 = 50:10:38.5:1.5），通过微流控技术封装mRNA。HEK 293T细胞和HepG2细胞用于体外表达验证，Pah-KO小鼠分为单次给药组（10 μg和60 μg剂量）和重复给药组（10 μg × 3次，5天间隔），通过尾静脉注射给药，检测血清Phe、体重变化、被毛颜色、ALT/AST水平、肝脏免疫组化（Immunohistochemistry, IHC）和苏木精-伊红（Hematoxylin-Eosin, H&E）染色等指标。

**四、主要研究结果**

*PAH sa-mRNA-LNP与PAH nr-mRNA-LNP的体外翻译能力比较评估*

在HEK 293T和HepG2细胞中，PAH sa-mRNA-LNP和PAH nr-mRNA-LNP均成功实现了PAH蛋白的细胞质表达（免疫荧光证实）。但表达动力学存在显著差异：nr-mRNA-LNP组PAH mRNA在转染后6小时即达到峰值（HEK 293T中为空白对照的3.55 × 10⁵倍），随后迅速下降；sa-mRNA-LNP组则在48小时（HEK 293T，4.10 × 10⁵倍）或24小时（HepG2，2.13 × 10⁵倍）达到更高峰值，并持续高水平表达至96小时。蛋白印迹（Western Blot）分析与mRNA动力学一致：nr-mRNA-LNP组蛋白表达在24小时短暂达峰（HEK 293T中为空白对照的2.78倍），随后衰减；sa-mRNA-LNP组则在72小时达到更高峰值（HEK 293T中为空白对照的4.7倍），并在72–96小时维持高表达。酶活性检测显示，sa-mRNA-LNP组在转染后第3天使Phe底物降低达90%，效应持续至第5天；而nr-mRNA-LNP组在第3天Phe水平即已反弹。上述结果证实sa-mRNA-LNP系统在不同细胞类型中均能实现延迟但持续的蛋白高水平生产，且酶活性持久。

*单次静脉注射PAH sa/nr-mRNA-LNP在Pah-KO小鼠中的治疗效果*

6周龄Pah-KO纯合子小鼠接受单次尾静脉注射。在60 μg高剂量组中，两种制剂在第1天均显著降低血清Phe（至约580 μmol/L），但nr-mRNA-LNP组在第2天即出现反弹并于第4天恢复至Pah-KO基线水平；sa-mRNA-LNP组则维持低Phe水平至第14天，至第42天仍接近正常。在10 μg低剂量组中，nr-mRNA-LNP仅在第1天将Phe降至约1,000 μmol/L后逐渐回升；而sa-mRNA-LNP同样在第1天达到约1,000 μmol/L后继续保持相对较低水平。被毛颜色方面，sa-mRNA-LNP两个剂量组在6周后均出现被毛颜色加深和正常化，nr-mRNA-LNP组与PBS对照无显著差异。肝脏IHC染色证实sa-mRNA-LNP组肝组织中存在明显PAH阳性染色（60 μg组阳性面积21.02%，10 μg组13.97%，均显著高于HO-PBS对照的8.04%），nr-mRNA-LNP组则与空白对照无异。H&E染色显示各组肝细胞形态规则、细胞核清晰，未见细胞肿胀、坏死或炎性细胞浸润。ALT和AST水平在各组均保持稳定，未见显著升高。上述结果表明，PAH sa-mRNA-LNP能够实现有效的肝脏靶向PAH表达，具有剂量节省效应和持续疗效，且安全性良好。

*重复静脉注射PAH sa/nr-mRNA-LNP在Pah-KO小鼠中的治疗效果*

采用5天治疗周期、3次尾静脉注射10 μg剂量的方案，评估重复给药的疗效和免疫应答。每次注射后24小时，sa-mRNA-LNP组血清Phe均显著下降至近正常水平，被毛颜色加深效应较nr-mRNA-LNP组更为显著；nr-mRNA-LNP组仅能将Phe降至约1,000 μmol/L。第11天肝脏IHC染色证实重复注射sa-mRNA-LNP在肝脏中产生了大量PAH蛋白。H&E染色显示各组肝组织结构和细胞形态未见明显异常。细胞因子白细胞介素-6（Interleukin-6, IL-6）检测显示，虽然在6小时时间点各组间存在显著差异，但24小时后均恢复至正常范围。上述结果表明，重复低剂量PAH sa-mRNA-LNP注射能够有效且持续地降低血清Phe，耐受性良好，未引起持续的炎症反应或肝组织损伤。

**五、讨论总结与研究结论**

本研究成功构建并系统评估了两种肝脏靶向LNP制剂用于PKU基因治疗的效果，PAH sa-mRNA-LNP在多个维度展现出相对于PAH nr-mRNA-LNP的显著优势：（1）疗效持续性——saRNA能够在细胞内通过nsP1–4非结构蛋白形成的RNA依赖性RNA聚合酶（RNA-Dependent RNA Polymerase, RDRP）以负链RNA为模板扩增基因组RNA并生成大量亚基因组RNA（Subgenomic RNA, sgRNA），实现信号的自我放大，从而使蛋白表达延迟但持久；（2）剂量节省——10 μg sa-mRNA-LNP即可达到60 μg nr-mRNA-LNP相当的疗效，有效降低了生产成本和潜在毒性风险；（3）安全性——两种制剂均表现出良好的安全性特征，ALT/AST水平稳定，肝脏组织学未见病理改变，重复sa-mRNA-LNP给药未引起IL-6持续升高，免疫原性极低；（4）肝脏靶向性——SM-102 LNP系统经内吞途径进入肝细胞后，利用溶酶体酸化引发的质子海绵效应（Proton Sponge Effect）释放封装RNA至细胞质，实现肝细胞特异性PAH表达。

研究结论：saRNA介导的PAH替代疗法能够以显著降低的剂量提供持续的酶活性，克服非复制型mRNA疗效短暂的局限。该平台或可为其他需要恢复肝功能的遗传性代谢疾病中的持久酶替代疗法提供更广泛的策略参考。

研究同时指出若干局限性：单次给药观察窗口（42天）和重复给药周期（11天）相对较短，对慢性PKU管理而言，长期安全性和疗效持久性评估尚不充分；剂量和给药频率评估中的小鼠样本量较小，可能限制最佳治疗剂量和给药间隔的结论稳健性，未来需扩大样本量以更精确地表征剂量-反应关系。后续研究方向包括推进I期临床试验以评估人体安全性和药代动力学特征，探索saRNA设计优化（如UTR工程化改造和nsP1–4非结构蛋白修饰）以增强翻译效率和降低固有免疫激活，以及开发靶向肝外组织的新型LNP制剂以拓展治疗范围。