大肠杆菌表面展示系统用于重组蛋白生产的工程化研究

《BioTech》：Engineering of Surface Display Systems in E. coli for Recombinant Protein Production

　　

摘要 蛋白制剂的分离纯化是许多生物化学研究领域中的关键任务。建立一个有效、简单且经济可行的重组蛋白生产系统，对于基础研究和应用生物技术均具有重要价值。大多数实验室研究侧重于细菌异源基因表达系统。然而，此类系统在表达具有特殊性质的目标蛋白时可能遇到重大困难。部分蛋白在过量表达过程中可能发生聚集、形成不溶性包涵体或遭受蛋白水解切割。此外，部分蛋白可能具有毒性，过量表达时会对宿主细胞产生不利影响。利用细胞分泌系统在生产过程中将目标蛋白输出至胞外，可规避上述问题。本研究比较了三种已建立的目标蛋白向细菌细胞表面输出的系统。研究人员选取了三种模型蛋白：细胞因子IL-17A、TEV蛋白酶催化结构域以及核结合蛋白1的钙结合结构域。研究人员使用了三种蛋白输出系统：第一种基于大肠杆菌外膜蛋白OmpA，第二种基于AIDA-I家族的大肠杆菌Ag43自转运蛋白，第三种基于丁香假单胞菌的冰核蛋白（INP）。重组蛋白通过定点化学蛋白酶解进行切割。

论文解读：大肠杆菌表面展示系统用于重组蛋白生产的工程化研究

一、研究背景与意义

重组蛋白生产在基础研究和应用生物技术领域均具有重要价值。大肠杆菌（Escherichia coli）是基础研究和生物技术产业中最常用、研究最深入的异源重组蛋白表达系统之一。然而，复杂蛋白的生产面临显著限制：部分蛋白在过量表达时形成不溶性包涵体，需经变性及复性处理；部分过量表达的肽段易被蛋白水解切割，或对宿主菌株的重要生理过程产生不利影响。可能的解决方案包括周质表达、将蛋白输出至培养基，或细胞表面展示。周质表达在大规模释放目标蛋白时存在挑战，因为需在不影响细胞质膜的前提下仅破坏外膜以释放周质中的目标蛋白。细胞表面展示系统可克服这一困难。与周质表达类似，表面展示可基本避免胞内聚集、目标蛋白被蛋白水解切割以及错误折叠蛋白积累等弊端。对于毒性蛋白，分泌还可防止产物影响表达宿主的必需生理过程。此外，将目标蛋白分泌至胞外可简化蛋白纯化流程。

目前已有多种表面展示系统被开发用于大肠杆菌表面展示重组蛋白，包括基于β-桶状外膜蛋白（如OmpA等）的Lpp-OmpA系统、基于AIDA-I家族单体自转运蛋白（AT）的系统，以及基于冰核蛋白（INP）的系统。然而，表面展示系统在重组蛋白生产领域的应用相对较少，主要挑战在于需要切割试剂将目标蛋白与载体蛋白分离。常用特异性蛋白酶切割连接序列，但蛋白酶可能产生非特异性作用，且需额外处理并纯化以去除蛋白酶污染。近年来报道了一种基于镍离子特异性切割特定氨基酸序列（-GSHHW-，即SNAC-tag）的技术，该方法无需额外步骤去除切割试剂。

二、研究内容与结论

研究人员开展了基础实验室规模研究，将多种目标蛋白表面输出系统与定点化学蛋白酶解相结合，构建了新型改良系统，使锚定于细胞表面的分泌型目标蛋白可通过化学蛋白酶解释放。研究人员选取了三种模型蛋白：单体蛋白TEV蛋白酶催化结构域、核结合蛋白1的钙结合结构域（CaBD），以及由二硫键稳定的二聚体蛋白IL-17A。研究构建了基于Lpp-OmpA、Ag43自转运蛋白和INP三种输出系统的共12种基因构建体，并对其表达、对细胞生长的影响、目标蛋白的表面展示及化学切割效率进行了系统分析。研究结果表明，Lpp-OmpA系统对细胞生长具有显著抑制作用，且需延长接头序列和修饰切割位点方可实现有效切割；Ag43和INP系统未显著影响细胞生长。通过荧光显微镜证实了目标蛋白在大肠杆菌表面的成功展示。在蛋白回收方面，IL-17A可通过SNAC_Ag43和INP_SNAC系统获得可溶性形式，TEV蛋白酶仅可通过INP_SNAC系统获得具有活性的可溶性形式，CaBD则仅可通过改良的Lpp-OmpA_SNAC(+)系统获得可溶性形式。所得蛋白的功能活性分别通过IL-17A与特异性抗体netakimab的相互作用、TEV蛋白酶的蛋白水解活性以及CaBD与RNA片段的特异性结合实验得到验证。

三、主要关键技术方法

研究人员使用了大肠杆菌Rosetta(DE3)表达菌株，采用T7表达系统进行蛋白过表达。研究构建了三种表面展示平台：基于Lpp-OmpA的Lpp_OmpA_SNAC系统、基于Ag43自转运蛋白的SNAC_Ag43系统，以及基于丁香假单胞菌INP的INP_SNAC系统。各系统均采用SNAC-tag（-GSHHW-）作为镍离子介导的化学切割位点。目标蛋白通过IVA克隆方法插入各平台载体。蛋白表达通过IPTG诱导，细胞表面展示通过荧光显微镜验证。目标蛋白通过NiCl₂化学蛋白酶解从细胞表面释放，并采用Ni-NTA琼脂糖亲和层析进行纯化。蛋白功能活性分别通过免疫共沉淀、酶活性测定和凝胶阻滞分析（EMSA）进行评估。

四、研究结果

4.1 基于Lpp-OmpA输出系统的基因构建体

Lpp_OmpA_SNAC平台构建体包含大肠杆菌脂蛋白Lpp信号肽及成熟Lpp前九个氨基酸、OmpA锚定序列（成熟OmpA蛋白46–159 aa）及SNAC-tag。目标蛋白位于嵌合蛋白C端。由于G^SHHW序列在该系统中切割效率不足，研究人员进一步构建了含延伸SNAC-tag（YFLPG^SHHWG）及额外接头的Lpp-OmpA_SNAC(+)系统。

4.2 基于Ag43自转运蛋白的基因构建体

SNAC_Ag43平台构建体包含PelB信号肽、SNAC-tag及Ag43转运结构域（700–1039 aa）。目标蛋白位于嵌合蛋白N端，即TEV_SNAC_Ag43、IL-17A_SNAC_Ag43和CaBD_SNAC_Ag43。

4.3 基于INP的基因构建体

INP_SNAC平台构建体包含PelB信号肽、INP N端片段（1–203 aa，含N端结构域及部分CRD）、接头序列（GGGSGG）及SNAC-tag。目标蛋白位于C端，即INP_SNAC_TEV、INP_SNAC_IL-17A和INP_SNAC_CaBD。

4.4 不同输出系统中重组蛋白基因的表达

所有锚定构建体均在大肠杆菌Rosetta(DE3)中有效过表达。含TEV、IL-17A或CaBD的嵌合蛋白在三种表面展示系统中均有效产生，但Lpp_OmpA_SNAC(+)系统中含TEV蛋白酶的嵌合蛋白除外。

4.5 输出系统对生产菌株生长的影响

OD₆₀₀比较及p值分析显示，仅Lpp-OmpA锚定蛋白及其表面展示构建体对细胞生长具有统计学显著影响。可能原因是过量OmpA导致外膜刚性增加，从而影响细胞分裂。Ag43和INP系统的嵌合蛋白表达未对大肠杆菌生长产生显著影响。

4.6 目标蛋白在大肠杆菌细胞表面展示的可视化

利用荧光显微镜对两种展示系统中的CaBD进行定位。在Lpp-OmpA_SNAC和SNAC_Ag43系统中，几乎所有细菌细胞均产生Alexa488荧光信号，证实目标蛋白的表面定位。未融合载体蛋白的CaBD未检测到表面信号。

4.7 目标蛋白的生产

4.7.1 重组IL-17A的生产及其与特异性抗体相互作用的评估

在SNAC_Ag43系统中，嵌合蛋白IL-17A_SNAC_Ag43被有效切割为IL-17A和SNAC_Ag43，IL-17A回收率为0.6±0.3%。在INP_SNAC系统中，切割后IL-17A与细胞膜结合，经1 M尿素处理后获得可溶性形式。在Lpp_OmpA_SNAC系统中，目标蛋白未被切割；采用延伸SNAC-tag的Lpp_OmpA_SNAC(+)系统后实现切割，但IL-17A仍与膜结合。功能分析表明，SNAC_Ag43和INP_SNAC系统生产的IL-17A均能与特异性抗体netakimab形成复合物。

4.7.2 TEV蛋白酶催化结构域的分离与活性评估

仅INP_SNAC系统可获得可溶性TEV蛋白酶制剂。在SNAC_Ag43系统中，TEV蛋白酶在化学切割后仍与细胞膜结合，2 M尿素处理未能将其释放至可溶性组分。Lpp_OmpA_SNAC系统中的嵌合蛋白未被切割，而Lpp_OmpA_SNAC(+)系统中TEV蛋白酶产量极低。活性分析显示，INP_SNAC系统生产的TEV蛋白酶可成功切割底物蛋白，效率为12±5%，而胞质表达对照组为83±8%。纯化制剂的平均活性分别为1200单位/mg（INP_SNAC系统）和8000单位/mg（胞质表达）。

4.7.3 核结合蛋白1重组CaBD的制备

与IL-17A和TEV蛋白酶类似，CaBD在Lpp_OmpA_SNAC系统中未被切割。在改良的Lpp_OmpA_SNAC(+)系统中，CaBD被有效切割，部分蛋白以可溶性形式回收。EMSA分析表明，该系统中生产的CaBD可与含特异性结合位点的RNA形成复合物，与胞质表达系统生产的CaBDc行为一致。

五、讨论与结论

研究对三种表面展示表达系统、三种模型蛋白、一种大肠杆菌菌株及有限IPTG诱导条件进行了系统比较。在12种目标蛋白/表达系统组合中，四种组合的蛋白回收率≤1.4%，其余八种为0%。尽管回收率较低，该方法在重组蛋白生产方面仍具应用前景。研究人员提出两个假设：其一，重组蛋白展示系统对蛋白生产的影响可能与锚定蛋白的分子尺寸有关，Lpp-OmpA系统中切割位点的可及性需延长接头方可实现，可能与OmpA较小的分子尺寸（约45×20 ?）有关；其二，展示蛋白的结构特性影响其分离流程，含α-螺旋结构的蛋白（如TEV蛋白酶）可能通过两亲性螺旋与膜脂结合而留在膜组分中，而主要由β-折叠结构组成的IL-17A与细胞膜的结合较弱。

研究结论：Lpp-OmpA输出系统对细胞生长具有抑制作用，且需特别注意接头序列和切割位点；SNAC_Ag43和INP_SNAC输出系统可获得可溶性重组蛋白，回收率最高达1.4%，但成功的蛋白回收需要针对具体蛋白进行个体化优化。本研究是寻找用于重组蛋白生产的最优表面展示表达系统的初步阶段，系统效率的评估主要基于定性而非定量分析。