2020年秋季斯洛伐克COVID-19疫情期间市政污水处理厂进水和处理后出水中的SARS-CoV-2 RNA试点监测研究

《Water》：Pilot Monitoring of SARS-CoV-2 RNA in Influent and Treated Effluent of Municipal Wastewater Treatment Plants Across Slovakia During the Autumn 2020 COVID-19 Wave

　　

摘要专业翻译 基于污水的监测（wastewater-based surveillance, WBS）可追踪社区SARS-CoV-2传播情况，但污水处理厂（wastewater treatment plant, WWTP）的RNA信号受采样、分析回收率及向固相转移等因素影响。研究人员在2020年10月至12月期间，对斯洛伐克8座市政污水处理厂的进水和生物处理出水中的SARS-CoV-2 RNA进行了定量检测。研究分析了27份24小时进水混合样和7份同日出水样，采用靶向ORF1b、S、E和RdRp基因的逆转录定量PCR（reverse-transcription quantitative PCR, RT-qPCR）进行检测。结果显示，27份进水样本中20份检出RNA（74%；95% CI，54–89%），7份出水样本中3份检出（43%；95% CI，10–82%）。进水病毒载量范围为4.66 × 109至5.60 × 1013拷贝/天；最大人口归一化载量为5.84 × 105拷贝/人口当量/天。全部7对出水的浓度均低于对应进水（精确符号检验，p = 0.0156）。可定量出水样本的表观log10削减值为0.18和0.76，检出限附近的一次检出约为1.75，4次未检出样本的削减值≥1.9至≥2.5。在选定厂开展的单日工艺剖面分析中，活性污泥上清液、消化污泥上清液及脱水滤液（reject water）中均检出RNA。由于未测定固体相、感染性及全流程回收率，本研究结果描述的是RNA的存在情况，而非病毒灭活或质量平衡。该试点数据为斯洛伐克提供了历史基线，并明确了重复采样、过程质控及配对液-固相测量的必要性。

论文解读

一、研究背景与研究意义

自2020年以来，基于污水的监测已从COVID-19应急工具发展为综合性传染病监测体系的组成部分。污水管网汇集了有症状和无症状感染者的排泄物，在临床检测可及性或接受度存在人群差异时，能够提供人群层面的流行趋势信息。SARS-CoV-2感染者的粪便排毒是城市污水中病毒RNA的主要来源，尽管个人卫生和家庭清洁过程中的冲洗也可能有所贡献。然而，从污水RNA反推感染率仍存在诸多不确定性，包括排毒速率、管网传输时间、稀释效应、流量、采样及分析回收率在不同汇水区和不同时间的变化。

在斯洛伐克，约66%的人口接入集中式污水管网，大型处理厂通常采用机械预处理、初沉、活性污泥营养物去除及污泥厌氧消化工艺。在污水处理过程中，病毒颗粒和游离RNA可能留在水相中、发生降解，或转移至悬浮及沉降固体上。有包膜病毒在水中的感染力丧失通常快于无包膜病毒，但RNA可能在感染力丧失后仍持续存在。已有研究表明，SARS-CoV-2 RNA在初沉污泥或活性污泥中的浓度比对应液相样品高1至3个数量级。水力停留时间（hydraulic retention time, HRT）、污泥停留时间（solids retention time, SRT）、污水组成及固液分离效果均可能影响进出水之间RNA浓度的表观变化。仅限液相样品的测量无法建立完整的病毒质量平衡。

分析性能同样至关重要。RT-qPCR结果受浓缩和提取方法、共提取抑制物、检测靶标、技术重复以及低于检测限结果的处理方式等多种因素影响。可靠的监测需要全流程回收率对照、抑制评估、阴性对照、明确的检出限（limit of detection, LoD）和定量限（limit of quantification, LoQ），以及对未检出结果的透明报告。RT-qPCR检测的是病毒RNA而非必然具有感染性的病毒，因此RNA浓度的下降不应被描述为病毒灭活，除非测定了感染性或经过验证的活性终点。

本研究旨在表征2020年秋季COVID-19疫情期间斯洛伐克8座市政污水处理厂进水和生物处理出水中的SARS-CoV-2 RNA，这些处理厂合计服务约1.0 × 10⁶人口当量（population equivalent, PE）。研究评估了进水浓度、日负荷和人口归一化负荷，7对同日进出水样本的表观log₁₀变化，ORF1b、S、E和RdRp四种检测靶标的检出差异，以及在选定处理厂开展的单日工艺剖面分析。该研究定位为历史试点数据集，而非全国流行率估计或污水处理性能的确定性比较。

二、研究设计与技术方法

研究覆盖2020年10月至12月，即斯洛伐克第二波COVID-19疫情的上升期和首个峰值期。全国实验室确诊发病率从10月初的约600例/天上升至11月底/12月初的约7000例/天。研究涉及8座匿名化处理厂（A–H厂），其中A–G厂采用粗格栅、沉砂、初沉（HRT 2–4小时）和低负荷活性污泥工艺，配置厌氧-缺氧-好氧生物营养物去除（AnDN），生物反应器SRT为20–28天，初沉污泥和二沉污泥经中温厌氧消化（35–40 °C）后离心脱水，分离液（reject water）回流至厂内进水端。H厂服务约4200人，采用单反应器同步硝化反硝化（SND）系统，SRT > 25天，配有未加热消化池（8–20 °C）。所有处理厂均无三级消毒、膜过滤或其他高级处理屏障。

采样采用冷藏自动采样器采集24小时时间比例混合样，每15分钟采集50 mL等分样（总计4.8 L），取0.5 L分样于采样完成后2小时内?20 °C冷冻保存。共获得27份进水混合样和7份出水混合样，出水样与对应进水样同日采集于B、C、D、E、F和H厂，其中C厂在两个日期配对采样。RNA提取采用低速离心去除粗悬浮物后超速离心浓缩病毒颗粒，TRI Reagent重悬后以Direct-zol? RNA Miniprep Kit提取。RT-qPCR检测四种SARS-CoV-2基因组区域：ORF1b、S、E和RdRp，同时运行GII F-RNA噬菌体检测以筛查扩增抑制。标准曲线采用合成SARS-CoV-2 RNA Control 1（Australia/VIC01/2020；GenBank MT007544.1）十倍稀释系列构建，效率90–105%，R² ≥ 0.98。回顾性操作检出限约为0.05拷贝/mL，定量限约为0.1拷贝/mL。日负荷按浓度乘以24小时流量计算，人口当量按BOD₅ 60 g PE^?1 day^?1（STN 75 6401标准）折算。统计分析采用Clopper–Pearson精确置信区间、精确符号检验和Cochran's Q检验。

三、研究结果

3.1 进水中的SARS-CoV-2 RNA。 27份进水样本中20份检出SARS-CoV-2 RNA（74%；95% CI，54–89%）。检出样本浓度范围为1至1163拷贝/mL，均高于操作检出限0.05拷贝/mL。日负荷范围为4.66 × 10⁹至5.60 × 10¹³拷贝/天，人口归一化负荷范围为750至584,348 × 10³拷贝 PE^?1 day^?1。最高归一化负荷出现在G厂11月10日、11月23日和10月15日，与全国报告发病率上升期相吻合。

3.2 进水和处理出水之间的表观变化。 7对同日进出水样本中，3份出水检出RNA（43%；95% CI，10–82%）。全部7对出水的浓度均低于对应进水（精确符号检验，p = 0.0156）。两对可定量出水的表观削减值为0.18 log₁₀（F厂）和0.76 log₁₀（D厂）。C厂12月5日出水在操作检出限处检出，半定量削减约1.75 log₁₀。4对出水中RNA低于检出限，报告为最小削减值≥1.9至≥2.5 log₁₀。

3.3 靶标特异性RT-qPCR检出。 32份样本完成全部四种靶标检测，ORF1b检出率50%，E和RdRp各34%，S为31%。Ct值总体偏高，ORF1b中位数37.15，E为35.3，RdRp为38.5，S为37.5。四种靶标检出频率无显著差异（Cochran's Q = 4.89，df = 3，p = 0.180）。高浓度样本中四种靶标均检出，低浓度时靶标结果不一致和高Ct值常见。

3.4 C厂单日处理工艺剖面（2020年12月5日）。 五个液相或沉降上清液样本均检出RNA。相对于进水（2.81拷贝/mL），活性污泥上清液为0.18拷贝/mL，处理出水为0.05拷贝/mL，消化污泥上清液为0.39拷贝/mL，脱水滤液为0.41拷贝/mL。脱水滤液为厌氧消化污泥离心脱水分离的液体，回流至厂内进水端。

四、讨论与结论

讨论部分总结： 斯洛伐克试点数据集捕捉了2020年秋季疫情期间进水SARS-CoV-2 RNA的显著时间和空间变异。G厂11月的最高值与全国报告发病率上升一致，而部分早期或晚期样本低于检出限。检出浓度量级（10³–1.16 × 10⁶拷贝/L）与欧洲污水研究报道的广泛范围重叠。全国抗原检测及隔离措施改变了临床病例确认情况，因此稀疏的污水采样无法将短期变化归因于单一干预措施。该数据集的价值在于提供斯洛伐克多厂历史基线和2020年信号获取时的分析及采样条件记录。

全部7对同日出水浓度均低于进水，符号检验确认了变化方向的一致性，但削减幅度差异较大（0.18至≥2.5 log₁₀）。这些值描述的是液相RNA浓度的表观下降，而非完整病毒的破坏。F厂的低削减可能与其高工业废水占比、基质效应或当日水力条件有关，但现有数据无法区分这些解释。3/7出水样本检出RNA表明二级处理并非总能将RNA降至本工作流的检出限以下，但这不证明排放了具有感染性的SARS-CoV-2。

C厂单日剖面记录了与活性污泥和厌氧污泥处理相关的液流中的RNA，与污泥固相富集病毒RNA的研究一致。脱水滤液回流至进水端可能在厂内再循环RNA片段。但样本为上清液而非污泥固体，无法量化固液分配、总质量转移或降解。质量平衡需同步液固测量、流量数据和全流程回收率对照。

主要局限包括采样日期数量少且不均、出水样本仅7份、工艺剖面仅1天、缺乏全流程加标。GII F-RNA噬菌体检测仅评估抑制，不能替代浓缩前加入的外源回收率对照。管网传输时间未获取。RT-qPCR检测RNA而非感染性，已有研究报道污水中SARS-CoV-2感染力丧失快于RNA，因此检出不应解释为活病毒。

对未来斯洛伐克监测的建议为：在代表性哨点厂每周采集24小时进水混合样，可行时采用流量比例采样，并预设持续上升后的强化采样标准。每项结果应包含全流程回收率对照、抑制评估、技术重复一致性、流量和汇水区元数据及样本特异性LoD/LoQ。研究涉及污水处理的归趋问题时采集配对液固样本，出水监测保留用于水回用、敏感受纳水体或消毒屏障验证等明确暴露问题。持续或矛盾的分子信号可通过数字PCR和测序确认，变异解释与临床基因组数据关联。同一基础设施可支持流感、呼吸道合胞病毒、肠道病毒和抗菌药物耐药标志物的综合One Health监测。

结论翻译： 本试点研究提供了2020年秋季斯洛伐克市政污水中SARS-CoV-2 RNA的多厂历史数据集。27份进水样本中20份检出RNA，7份处理出水样本中3份检出。全部7对同日样本显示二级处理后RNA浓度降低，但表观削减幅度从可定量出水的0.18至0.76 log₁₀、检出限处一次检出的约1.75 log₁₀，到4个下限估计的≥1.9至≥2.5 log₁₀不等。C厂单日剖面还证明活性污泥上清液、消化污泥上清液和脱水滤液中存在可测量的RNA。这些发现确定了RNA浓度的存在情况和方向性变化，但不证明病毒灭活、感染性病毒排放或完整质量平衡。最切实的结论是方法学层面的：在量化污水处理性能或公共卫生风险之前，必须进行重复采样、加入外源全流程回收率对照、透明处理未检出结果并进行配对液固测量。在这些保障措施和与临床监测整合的前提下，2020年数据集可作为斯洛伐克未来多病原体污水监测的可重复基线。