《iScience》：PP2A and CDK16 antagonistically regulate WIPI2B phosphorylation and neuronal autophagosome biogenesis
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自噬是一种回收细胞组分的稳态机制。在原代小鼠神经元中，自噬体生物发生在衰老过程中下降。重要的是，这种下降可以通过关键自噬组分WIPI2B的异位表达来恢复。WIPI2B丝氨酸395（S395）的磷酸化状态对于这种恢复至关重要，表明WIPI2B S395磷酸化调节
自噬是一种回收细胞组分的稳态机制。在原代小鼠神经元中，自噬体生物发生在衰老过程中下降。重要的是，这种下降可以通过关键自噬组分WIPI2B的异位表达来恢复。WIPI2B丝氨酸395（S395）的磷酸化状态对于这种恢复至关重要，表明WIPI2B S395磷酸化调节自噬体生物发生。在此，研究人员鉴定了蛋白磷酸酶2A（PP2A）和CDK16作为WIPI2B S395磷酸化和神经元自噬的调节因子。利用秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans），研究人员证明了PP2A和CDK16通过与WIPI2B相同的遗传途径调节神经元自噬。此外，纯化的哺乳动物PP2A和CDK16在体外直接修饰WIPI2B S395磷酸化。在原代小鼠神经元中，PP2A和CDK16与WIPI2B在自噬体上共定位，并且操纵PP2A和CDK16的表达改变了WIPI2B斑点形成和自噬体生物发生的速率。总之，这些数据支持PP2A和CDK16调节WIPI2B S395磷酸化，从而调节神经元中自噬体生物发生的结论。
自噬（autophagy）是一种进化上保守的细胞回收途径，通过形成双层膜自噬体（autophagosome）降解蛋白聚集体和功能异常的细胞器。神经元是高度代谢活跃、终末分化和长寿的细胞，严重依赖基础自噬维持稳态；自噬失调与多种神经退行性疾病相关。研究人员此前发现原代小鼠背根神经节（DRG）神经元中自噬体生物发生速率随衰老显著下降，而异位表达WIPI2B可恢复该速率，且恢复能力依赖于WIPI2B第395位丝氨酸（S395）的磷酸化状态：磷酸化缺失突变体WIPI2B(S395A)可恢复，磷酸化模拟突变体WIPI2B(S395E)不能。这表明WIPI2B S395磷酸化是自噬体生物发生的负调控因素，但调控该位点的激酶和磷酸酶此前未知。因此，该研究旨在鉴定神经元中调节WIPI2B S395磷酸化的分子调控因子，为通过调节WIPI2B功能来对抗衰老相关自噬下降提供潜在治疗靶点。
研究人员利用秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）作为体内筛选平台，首先确认线虫ATG-18（WIPI2B直系同源蛋白）存在对应位点丝氨酸375（S375），并利用CRISPR生成S375A（磷酸化缺失）和S375E（磷酸化模拟）突变体，以PVD神经元轴突长度作为自噬功能的读出表型。结果显示，atg-18(S375E)突变体轴突显著长于野生型，而atg-18(S375A)与野生型相似，表明ATG-18 S375磷酸化状态调节体内神经元自噬。在此基础上，通过候选磷酸酶突变体筛选，发现PP2A调节亚基SUR-6、PPTR-1和PPTR-2的功能缺失突变体均表现出类似atg-18(S375E)的长轴突表型；遗传上位分析表明atg-18作用于sur-6下游，提示PP2A通过去磷酸化ATG-18 S375调节自噬。体外去磷酸化实验进一步证实，纯化的人重组PP2A可直接降低WIPI2B尾肽段（含S395）的磷酸化水平。对于激酶，研究人员利用候选激酶突变体与sur-6双突变筛选，发现pct-1、cdk-5和unc-43可抑制sur-6表型；但随后的上位分析显示仅pct-1与atg-18在同一遗传途径中，PCT-1是哺乳动物CDK16的线虫直系同源物。体外激酶实验表明，人重组CDK16可直接磷酸化WIPI2B S395，而CaMKIIα无效。在原代小鼠DRG神经元中，Halo标记的PP2A调节亚基B55α/B55δ和CDK16/17/18与SNAP-WIPI2B及GFP-LC3B标记的自噬体共定位；过表达CDK16减少WIPI2B斑点形成和自噬体生成速率，且该效应依赖WIPI2B S395；siRNA敲低B55α而非B55δ显著降低自噬体生物发生速率，而敲低CDK16无显著影响，可能存在CDK17/18代偿。综上，PP2A（B55α）与CDK16拮抗调节WIPI2B S395磷酸化，从而调控神经元自噬体生物发生。
主要技术方法：研究人员采用CRISPR/Cas9共注射方案在线虫内源位点引入点突变；利用PVD轴突长度表型进行遗传筛选；通过体外磷酸化/去磷酸化实验检测重组酶活性；使用原代DRG神经元（来源于GFP-LC3B转基因小鼠与C57BL/6J小鼠杂交后代，11–26月龄）进行活细胞共聚焦成像、Halo/SNAP标记共定位及siRNA敲低实验。
研究结果分述如下。
**ATG-18 S375磷酸化调控线虫神经元自噬**。通过CRISPR构建atg-18(S375A)、atg-18(S375E)和PI3P结合缺陷突变体atg-18(FTTG)，观察L4期PVD轴突长度。发现atg-18(LOF)和atg-18(FTTG)轴突显著变长，atg-18(S375A)与野生型相似，atg-18(S375E)轴突长于野生型但弱于LOF，表明S375磷酸化水平调控自噬功能。
**PP2A调节亚基调控线虫PVD轴突生长**。检测PPP3催化亚基tax-6和PP2A调节亚基sur-6、pptr-1、pptr-2突变体，发现PP2A调节亚基突变表型与atg-18(S375E)一致；atg-18(S375A); sur-6双突变轴突短于sur-6单突变，表明atg-18作用于sur-6下游。
**PP2A在体外直接去磷酸化WIPI2B**。制备GST-HA标签的WIPI2B C端尾肽（含S395），用脑匀浆使其磷酸化，再加入重组PP2A，免疫印迹显示S395磷酸化信号显著降低。
**CDK16调控线虫PVD轴突生长**。激酶突变体与sur-6双突变筛选中，pct-1、cdk-5、unc-43可抑制sur-6长轴突表型；但仅pct-1与atg-18(S375E)双突变仍保持长轴突，atg-18(S375A); pct-1双突变与野生型类似，证明pct-1与atg-18同通路。
**CDK16在体外磷酸化WIPI2B**。使用Cdk1/2抑制剂III抑制脑匀浆介导的WIPI2B磷酸化，重组CDK16+Cyclin Y可直接增加S395磷酸化，而CaMKIIα不能。
**PP2A和CDK16调节原代神经元中WIPI2B斑点和自噬体生成**。共定位实验显示相关蛋白共定位于自噬体；CDK16过表达降低WIPI2B斑点数和AV生成率，而S395A突变可抵抗此效应；B55α敲低降低AV生成率，B55δ无效，CDK16敲低无显著改变。
讨论部分总结：研究首次在线虫和哺乳动物中鉴定出PP2A-B55α和CDK16为WIPI2B S395磷酸化的关键调控因子。PP2A-B55α去磷酸化促进自噬体生物发生，CDK16磷酸化促进WIPI2B从膜上解离。该调控网络为“黄金比例”水平调节神经元自噬提供了干预靶点，尤其对衰老相关自噬下降和神经退行性疾病治疗有意义。但研究存在局限性，如候选筛选可能遗漏其他因子，未深入分析CDK17/18代偿作用。
结论翻译：综上所述，研究人员的数据支持PP2A和CDK16调节WIPI2B S395磷酸化，从而调节神经元中自噬体生物发生的结论。
