《Current Issues in Molecular Biology》：Rat TNF-Related Apoptosis-Inducing Ligand (rTRAIL)-Expressing Rat-Adipose-Derived Stem Cells (rADSC) Moderately Limit Growth of Rat Mammary Cancer Cells—A Pilot Study
编辑推荐：
背景：脂肪间充质干细胞（ADSCs）是易于获取且具有肿瘤归巢能力的细胞，已被改造为抗肿瘤药物的递送载体。肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）可通过死亡受体DR4/DR5选择性地触发多种癌细胞的凋亡，同时不伤害大多数健康细胞。迄今为止，此类递送系统中仅有人
背景：脂肪间充质干细胞（ADSCs）是易于获取且具有肿瘤归巢能力的细胞，已被改造为抗肿瘤药物的递送载体。肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）可通过死亡受体DR4/DR5选择性地触发多种癌细胞的凋亡，同时不伤害大多数健康细胞。迄今为止，此类递送系统中仅有人源TRAIL被研究；完全同源的大鼠模型（即由大鼠ADSC递送大鼠TRAIL）尽管对于未来的同基因体内研究至关重要，却尚未得到验证。方法：在这项初步探索性研究中，研究人员利用慢病毒转导大鼠ADSC（rADSC）以表达myc标签标记的大鼠TRAIL，在mRNA和蛋白质水平上表征了rADSC及三种大鼠乳腺腺癌细胞系（RBA、HH-16.cl.4、SHZ-88）中TRAIL通路组分的表达，并通过重组TRAIL剂量反应实验、上清液转移实验、直接共培养实验以及为期九天的插入式共培养实验评估了rTRAIL-rADSC的抗肿瘤效果。结果：rADSC被成功转导并产生细胞相关型大鼠TRAIL（每50,000个细胞66.2 pg，对照组为4.4–5.7 pg；p < 0.05）；此ELISA检测的是总细胞相关型（胞内加膜锚定）TRAIL，而非可溶性TRAIL。rADSC表达的诱饵分子骨保护素以及DR4/DR5的水平显著高于癌细胞。三种癌细胞系中的两种（RBA、HH-16.cl.4）对大鼠TRAIL敏感，rTRAIL-rADSC可降低其生长并增加死细胞比例，其形态学特征同时符合凋亡和坏死，在HH-16.cl.4中最为显著；该效应在HH-16.cl.4中可与空载体对照区分，但在RBA中则不能。结论：在这项初步研究中，由rADSC递送的同源大鼠TRAIL是可行的，并能增加对TRAIL敏感的大鼠乳腺癌细胞的死亡，但效应至多为中度、依赖细胞接触，且在两种敏感细胞系中的一种其效应并不能归因于TRAIL本身。这些发现界定了基于TRAIL的生物学近距离放疗的全转化大鼠模型的潜力与局限性，并为未来的体内研究奠定了基础。
**研究背景与现存问题**
乳腺癌是全球最常见恶性肿瘤，2020年新发病例约226万。乳房切除术后5年内复发风险为7%–13%，为降低该风险，术后常辅以化疗或放疗，但两者均伴随全身及局部并发症，因此亟需局部、低毒副作用的替代策略。生物学近距离放疗（biologic brachytherapy）概念由Michaels等人首次提出，利用分子生物学工具使有限体积的组织产生目标治疗性蛋白，直接在瘤床局部递送治疗。肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）是一种同源三聚体蛋白，通过死亡受体DR4/DR5优先诱导肿瘤细胞凋亡而不伤害正常细胞，具有治疗潜力。然而，目前所有研究均使用人TRAIL，大鼠TRAIL同源物及其在完全同源大鼠模型中的效果从未被测试。间充质干细胞（MSC）因其肿瘤归巢能力成为局部递送载体，其中脂肪间充质干细胞（ADSC）因易于从脂肪获取而更具优势，但其在乳腺癌治疗中的应用受限，因为部分乳腺癌细胞系对TRAIL诱导的凋亡存在部分耐药性。此外，有研究提示ADSC本身可能通过其他途径促进乳腺癌生长与复发。因此，表征ADSC与癌细胞之间TRAIL通路组分的差异至关重要：递送载体需自身抵抗TRAIL诱导的凋亡，而靶细胞须表达功能性DR4/DR5且诱饵机制有限。本研究的目的是建立慢病毒转导的大鼠TRAIL表达脂肪间充质干细胞（rTRAIL-rADSC）模型，并检测其对大鼠乳腺癌细胞的作用。
**研究内容与结论概述**
研究人员成功构建了含N端myc标签的大鼠TRAIL基因的慢病毒载体，转导大鼠脂肪间充质干细胞（rADSC），并鉴定其表达。在mRNA和蛋白质水平上比较了rADSC与三种大鼠乳腺腺癌细胞系（RBA、HH-16.cl.4、SHZ-88）中TRAIL通路组分的表达差异。结果显示rADSC可成功转导并产生细胞相关型大鼠TRAIL，且自身对TRAIL诱导的凋亡不敏感。三种癌细胞系中两种（RBA、HH-16.cl.4）对重组大鼠TRAIL敏感，rTRAIL-rADSC在直接共培养和插入式共培养中可增加癌细胞死亡并降低其生长，效应以HH-16.cl.4最为显著，但总体效应为中度，且在RBA系中该效应不能与转导载体本身效应区分。该研究首次建立了完全同源的大鼠TRAIL递送系统，为未来体内研究提供了基础，同时也揭示了该策略的局限性。
**主要关键技术方法**
研究人员从Sprague–Dawley大鼠肾脏组织提取总RNA并逆转录为cDNA，采用高保真聚合酶扩增获得全长大鼠TRAIL基因并克隆至Plvx-CMV-IRES-Zsgreen1载体。利用第四代慢病毒包装系统（VSV-G包膜）生成慢病毒颗粒，经p24衣壳抗原检测估算滴度，并将rADSC（购自iXCells Biotechnologies，源自腹股沟白色脂肪垫）转导。表征实验中采用实时定量PCR和Western blot检测TRAIL通路组分（DR4、DR5、OPG、C-FLIP、TNFRSF22、TNFRSF26）表达。功能实验包括重组TRAIL剂量反应实验、转导细胞上清液转移实验、直接共培养实验（Hoechst 33342/碘化丙啶染色结合荧光显微镜计数凋亡与坏死细胞）以及9天插入式共培养实验（Transwell，3 μm孔径，结晶紫染色计数）。ELISA法检测细胞相关型TRAIL浓度。
**研究结果**
**3.1 rADSC可被慢病毒转导并产生大鼠TRAIL**
成功构建含myc标签大鼠TRAIL基因和Zsgreen1荧光蛋白的质粒，经Sanger测序确认序列正确。慢病毒滴度约5 × 10? IFU/mL。转导后rADSC在72 h荧光强度最高，并保持亲本细胞的纺锤形、贴壁生长形态，且未因自身TRAIL产生而出现细胞毒性。冻融裂解物ELISA检测结果显示，转导细胞总细胞相关型TRAIL浓度为每50,000个细胞66.2 pg，显著高于对照组（5.73 pg和4.43 pg；p < 0.05）。长期培养观察显示，报告基因荧光强度在约6天后显著下降，提示转基因表达随时间衰减。
**3.2 rADSC与乳腺癌细胞中TRAIL通路相关蛋白表达存在差异**
与三种乳腺腺癌细胞系相比，rADSC在mRNA和蛋白质水平上均显著高表达OPG、DR4和DR5。癌细胞系中TNFRSF22 mRNA水平高于rADSC，而TNFRSF26 mRNA水平低于rADSC。在RBA和SHZ-88细胞中，OPG蛋白丰度与RNA水平不完全一致，提示存在转录后调控机制。C-FLIP在rADSC蛋白水平上表达显著而mRNA水平差异不明显。
**3.3 三种乳腺癌细胞系中两种对重组大鼠TRAIL敏感**
以0–100 ng/mL重组大鼠TRAIL处理24小时的定性筛选实验显示，RBA和HH-16.cl.4活力下降，而SHZ-88基本不受影响。细胞无上清液转移实验显示，mycTRAIL-rADSC上清液对癌细胞活力的抑制作用很小且未达统计学显著，提示该膜锚定型TRAIL以细胞接触依赖的方式起作用。
**3.4 mycTRAIL转导rADSC在直接和间接共培养中均增加癌细胞死亡**
Hoechst 33342/碘化丙啶染色结合荧光显微镜计数显示，与mycTRAIL-rADSC共培养的癌细胞中凋亡细胞、坏死细胞及总死细胞比例均高于Zsgreen1-rADSC或未转导rADSC处理组（两因素方差分析，p ≤ 0.05），以HH-16.cl.4变化最大。同时存在PI阳性（坏死）与核固缩（凋亡）细胞，提示混合型死亡模式。Western blot检测裂解的caspase-3未发现组间一致差异，可能因单一24 h时间点错过caspase-3激活的短暂窗口，死亡结论基于形态学结果。
**3.5 mycTRAIL转导rADSC对TRAIL敏感乳腺癌细胞增殖的长期影响**
9天插入式共培养实验中，对于HH-16.cl.4，mycTRAIL-rADSC处理组细胞数低于Zsgreen1-rADSC空载体对照组，表明TRAIL可归因的效应存在。对于RBA，空载体rADSC与mycTRAIL-rADSC同样程度地降低细胞数，故该细胞系的生长抑制归因于转导rADSC本身而非TRAIL。
**讨论部分总结**
研究人员指出，rADSC在慢病毒转导后保持形态并可持续表达转基因，但表达在6天后显著下降，这构成该策略的中心限制。rADSC高表达OPG可能解释其自身对TRAIL的耐受。不同癌细胞系间TRAIL敏感性与OPG表达相关，SHZ-88高表达OPG且对TRAIL抵抗，其生物学特征与PR+/ER+乳腺癌相似，RBA与HH-16.cl.4分别类似三阴性乳腺癌和HER2+乳腺癌。上清液试验效果弱而共培养效果好，表明膜锚定型TRAIL主要通过细胞接触发挥作用。效应特异性方面，TRAIL可归因的效应在HH-16.cl.4中明确但在RBA中不能确定。研究局限包括：治疗效果多采用非特异性比色法测定、部分效应未达统计显著、转基因表达时间短、RBA中载体效应与TRAIL效应无法区分、可溶性及细胞表面TRAIL未直接定量、仅为体外研究等。研究人员认为，完全同源的大鼠TRAIL递送模型可行但效果仅为中度，提示大鼠TRAIL作为人TRAIL同源物在动物模型中的效力仍需验证。局部、持久的生物学近距离放疗策略显示出前景，需开展动物研究证实其疗效。
**研究结论**
这是首次报告完全同源的体外TRAIL治疗研究，即大鼠脂肪间充质干细胞递送大鼠TRAIL作用于大鼠乳腺癌细胞。在此初步研究中，治疗效果为中度，并对癌细胞系的TRAIL敏感性存在依赖；该效应在HH-16.cl.4中可与转导载体的效应区分，但在RBA中则不能。有限的疗效引发一个问题：在动物模型中，大鼠TRAIL是否是人TRAIL的合适同源物。数据表明，该效应空间上局限于转导细胞邻近区域。尽管如此，作为一种持久且精准的局部辅助疗法（生物学近距离放疗），该策略显示出前景，尚需动物实验确认其疗效。
