肌源性调控失调是Beckwith-Wiedemann综合征舌体过度生长的基础

《iScience》：Myogenic dysregulation underlies human tongue overgrowth in Beckwith-Wiedemann syndrome

　　

Beckwith-Wiedemann综合征（BWS）的巨舌症（macroglossia）具有重要临床意义，但舌体过度生长的细胞学基础仍不明确。研究人员利用来自分子定义BWS亚型的儿童舌标本和年龄匹配的非BWS对照标本，发现BWS巨舌症的特征是骨骼肌纤维肥大（hypertrophy）而非纤维数量增加。这一表型并非由原位（in situ）卫星细胞（satellite cell）的扩增或增殖增加所解释，分离的舌卫星细胞在体外生长条件下也未表现出增强的增殖能力。相反，BWS祖细胞采用不同的分化相关调控状态。印迹控制区2（imprinting control region 2，IC2）缺失甲基化（loss-of-methylation，LOM）细胞在分化过程中维持增殖活性并形成增大的肌管（myotube），与细胞自主性肥大程序一致。相比之下，11号染色体父源单亲二体（paternal uniparental disomy of chromosome 11，pUPD11）细胞表现出NOTCH通路激活和祖细胞相关程序，向终末肌源性分化的进展减弱。综上，这些发现确定了亚型特异性的肌源性状态，这些状态在BWS巨舌症中汇聚于共同的肥大组织表型。

研究背景与科学问题

Beckwith-Wiedemann综合征（BWS）是一种以体细胞过度生长、发育异常和肿瘤风险增加为特征的印迹性疾病，多由11p15染色体区域两个印迹控制区（IC1和IC2）的表观遗传或遗传改变所致。巨舌症是BWS最具临床意义的表型之一，可导致气道阻塞、喂养困难和语言障碍，常需手术减容。此前关于BWS巨舌症是基于肌纤维肥大还是肌纤维增生（hyperplasia）存在矛盾的病例报告，且受样本量小、分析成人组织或缺乏儿童对照限制；不同分子亚型（IC2 LOM与pUPD11）如何影响舌体过度生长的细胞机制也几乎未知。因此，研究人员利用分子定义的患者儿童舌标本和合适的年龄匹配对照，系统阐明巨舌症的细胞基础。

研究人员开展了什么研究

研究人员收集了接受舌减容手术的分子定义BWS患儿舌标本，以及年龄匹配的非BWS儿童尸检舌标本，结合组织学、免疫荧光、流式分选、原代卫星细胞培养和极低起始量RNA测序，比较了主要BWS亚型IC2 LOM和pUPD11的肌源性特征。结果发现，两种亚型的巨舌症均以骨骼肌纤维肥大为主要组织学特征，而非纤维数目增加；原位舌卫星细胞的丰度和增殖活性并未增加。体外功能分析显示，IC2 LOM卫星细胞在分化过程中持续增殖并形成增大肌管，而pUPD11细胞呈现NOTCH信号激活、祖细胞相关基因上调以及终末肌分化基因下调。该研究首次将BWS巨舌症的细胞基础明确为肌纤维肥大，并揭示不同表观遗传亚型通过不同肌源性调控程序汇聚于同一组织表型，为理解亚型特异性肌源性失调提供了机制框架。

关键技术方法

研究人员采用以下主要方法：组织学和肌纤维横截面积（CSA）定量分析；免疫荧光检测PAX3、PAX7、MYOD和KI67以评估原位卫星细胞丰度与增殖；荧光激活细胞分选（FACS）以CD324^-/CD45^-/CD82⁺/CD56⁺标志从冻存舌组织中分离活卫星细胞；体外EdU掺入增殖实验、分化及融合指数/MyHC阳性面积分析；极低起始量批量RNA测序（RNA-seq）并结合Reactome/Enrichr通路富集、STRING网络分析和基因集富集分析（GSEA）；分化时间进程EdU脉冲标记和In-cell western检测NOTCH、KI67、MYOGENIN蛋白表达。样本队列来源：BWS舌标本来自CHOP BWS注册库（IRB 13-010658）的舌减容手术；非BWS对照来自Boston Children’s Hospital和Texas Children’s Hospital的3岁以下儿童尸检标本。

研究结果

（1）BWS相关巨舌症以骨骼肌纤维肥大为特征。组织学观察和纤维CSA定量显示，IC2 LOM与pUPD11舌标本的肌纤维均显著大于非BWS对照；纤维大小分布分析显示对照纤维较小，而IC2 LOM与pUPD11之间的纤维大小分布相似。说明巨舌症由纤维肥大而非纤维数目增加导致。

（2）BWS舌中原位卫星细胞丰度和增殖活性并未增加。免疫荧光染色显示PAX3⁺和PAX7⁺细胞数量在三组间相似；KI67共染未显示卫星细胞增殖差异；MYOD表达和MYOD⁺细胞中KI67⁺比例也无显著差异。

（3）体外生长条件下BWS舌卫星细胞未表现出增强的增殖。用CD56/CD82分选活卫星细胞并在生长培养基培养4天后，EdU掺入比例在对照、IC2 LOM和pUPD11之间无统计学差异，提示体内肥大不能用离体增殖增强解释。

（4）IC2 LOM卫星细胞在分化过程中形成增大肌管。分化诱导后各组均形成肌管，MYOGENIN早期表达无差异；但MyHC染色显示IC2 LOM培养物中肌管增大、核聚集，MyHC阳性面积显著增加，融合指数无显著差异。

（5）RNA测序鉴定出分化过程中亚型特异性信号程序。主成分分析显示对照与BWS样本分离，IC2