《iScience》：Benchmarking immunoinformatic repertoire assemblies from bulk RNA-seq and PCR-based V(D)J sequencing using PCR-free SMRT RNA sequencing
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免疫组库测序（RepSeq）是一项关键的免疫监测工具，要求高灵敏度、高准确度和极低偏倚。尽管基于5′ cDNA末端快速扩增的V(D)J mRNA测序（RACE-RepSeq）被广泛使用，但其对PCR的依赖可能引入偏差。此外，通过计算 bulk RNA-se
免疫组库测序（RepSeq）是一项关键的免疫监测工具，要求高灵敏度、高准确度和极低偏倚。尽管基于5′ cDNA末端快速扩增的V(D)J mRNA测序（RACE-RepSeq）被广泛使用，但其对PCR的依赖可能引入偏差。此外，通过计算 bulk RNA-seq 数据进行 in silico 免疫组库重建（ISRR）的工具在准确性方面亦存有争议。研究人员将RACE-RepSeq和ISRR与一种基于全长转录本单分子实时（SMRT）测序的先进PCR-independent方法进行了比较。三种方法应用于免疫球蛋白转录本时，在V/J基因使用、CDR3特征和多样性指数等免疫组库整体指标上均表现一致。然而，在体细胞超突变（SHM）评估、同种型分布以及单个克隆水平上则出现了差异，包括克隆重叠不完全和同种型分配不一致，即使在丰度较高的克隆中也是如此。这些方法学偏差超过了抽样效应的影响。总体而言，研究结果界定了每种方法在B细胞丰富组织样本中的局限性，并支持SMRT测序作为免疫组库基准评估的有用参考标准。
**论文解读**
**一、研究背景与问题**
高通量免疫组库测序已深刻推动了研究人员对适应性免疫应答的理解，覆盖生理状态、感染与疫苗诱导免疫、免疫失调性疾病以及恶性血液病等多种背景。与T细胞组库相比，B细胞组库的捕获更为复杂，原因在于B细胞在次级淋巴器官中被抗原激活后，免疫球蛋白（Ig）可变区基因会引入体细胞超突变（SHM，即抗体亲和力成熟过程中在V区基因中累积的点突变）。此外，Ig同种型（isotype）的鉴定也至关重要，不同同种型具有不同的功能和药理学特征。
目前已有多种方法可对组织、肿瘤样本、外周血或分选淋巴细胞亚群的整体免疫组库进行分析，方法的选择主要取决于生物材料的可用性和具体研究目的。以mRNA为起始材料的RACE-RepSeq（利用5′ cDNA末端快速扩增进行V(D)J转录本测序）被广泛视为当前的"金标准"。然而，RACE-RepSeq依赖多个酶促步骤，包括逆转录和PCR扩增，可能在克隆定量和序列保真度方面引入偏差。另一方面，许多实验和临床场景中，专门的免疫组库测序无法实施，此时基于 bulk RNA-seq 数据的 in silico 免疫组库重建（ISRR）工具（如TRUST4）提供了一种事后分析的替代策略。然而，ISRR需从具有高度序列同源性的多基因家族产生的短读段中重建完整的V(D)J序列，其克隆重建、定量和同种型分配的准确性仍不确定，且此前尚未针对不依赖PCR的实验方法进行系统性验证。
近年来，基于单分子实时（SMRT）测序的长读长RNA-seq技术成为免疫组库分析的一种有前景的替代方案。通过实现近全长Ig转录本的测序，SMRT技术理论上可以克服短读长数据固有的组装歧义，并直接获取恒定区信息。然而，已发表的基于SMRT的免疫组库研究通常保留了PCR扩增步骤，限制了其作为无偏倚参考标准评估PCR依赖方法的能力。
**二、研究内容与意义**
本研究使用PCR-independent SMRT RNA-seq对全长转录本进行测序，为评估基于RNA的免疫组库分析方法提供了可靠的基准。研究人员从人扁桃体（一种广泛使用的次级淋巴器官）中纯化获得类别转换记忆B细胞（n = 3），采用三种策略平行评估IGH免疫组库：RACE-RepSeq、基于TRUST4的ISRR（依赖2 × 150 bp bulk RNA-seq数据）以及SMRT长读长测序。PCR-independent SMRT测序被用作参考方法，因其直接捕获全长Ig转录本而无需靶向扩增。
研究发现，三种方法在全免疫组库层面表现出高度一致性：V/J基因使用模式、CDR3长度分布以及CDR3区的理化性质均高度相似，表明RACE-RepSeq和ISRR都能稳健地捕捉IGH免疫组库的整体架构。然而，在克隆级别分析中，三种方法之间出现了实质性差异。即使在限制分析最丰度克隆（前10或前25位）时，部分克隆仅被一种方法检测到，部分克隆的相对频率存在显著差异（可达约30倍）。通过靶向扩增和深度测序对仅被单一方法鉴定为高丰度的克隆进行正交验证，结果显示：RACE-RepSeq独有的高丰度克隆均被成功验证为高丰度；而ISRR独有的高丰度克隆在靶向扩增文库中仅以低频率被检测到（排名248至4529位不等）。
这些结果表明，RACE-RepSeq对丰度克隆的定量更为可靠，而ISRR中部分克隆的丰度估计可能存在偏倚。此外，同种型分配方面，RACE-RepSeq因使用IGHM、IGHG和IGHA特异性引物分别进行cDNA合成和PCR，可能人为夸大了IGHM的表达比例。在SHM评估中，RACE-RepSeq倾向于高估突变水平（可能源于PCR错误），而TRUST4则可能因组装过程中使用共有序列而低估SHM水平。SMRT测序因不依赖PCR扩增，提供了更为保守的突变频率估计。
该研究的重要学术意义在于：（1）首次以PCR-independent SMRT测序为参考，系统评估了两种最广泛使用的RNA-based免疫组库分析方法的性能；（2）明确了RACE-RepSeq和ISRR在全免疫组库层面分析中的可靠性，为感染性疾病、疫苗接种和自身免疫等以组库整体特征为主要关注点的研究提供了方法学支撑；（3）同时揭示了两种方法在克隆级别分析中的局限性，这对微小残留病监测、淋巴恶性肿瘤中优势克隆追踪等应用具有直接指导意义。
**三、关键技术方法**
研究对象为来自法国雷恩诊所（Clinique de la Sagesse, Rennes, France）常规扁桃体切除术患者的3例人腭扁桃体样本。新鲜样本经处理后，通过密度梯度离心分离单个核细胞，使用人类别转换记忆B细胞分离试剂盒（Miltenyi Biotec）进行负向磁珠分选富集类别转换记忆B细胞。总RNA通过TRIzol试剂提取，仅使用RNA完整性指数（RIN）大于7的样本。RACE-RepSeq使用Superscript IV逆转录酶和针对Cμ、Cγ、Cα恒定区的巢式引物进行文库构建，在Illumina MiSeq平台进行2 × 300 bp双端测序。Short-read RNA-seq使用TruSeq链特异性mRNA文库制备试剂盒在Illumina NovaSeq平台进行2 × 150 bp双端测序，每样本约15 Gb数据。SMRT长读长测序使用SMRTbell文库制备试剂盒（Iso-Seq）在PacBio Revio系统上进行，每样本约10.5 Gb数据。ISRR使用TRUST4 v1.0.5.1以默认参数从 bulk RNA-seq 数据中重建IGH序列。V(D)J基因分配通过IMGT/HighV-QUEST完成，克隆分配使用SCOPer包的hierarchicalClones函数。免疫组库多样性通过immunarch包计算Hill多样性曲线，SHM频率以每100个比对IGHV核苷酸中的突变数计算。
**四、研究结果**
*方法相关参数：IGH免疫组库回收率的预期差异*
三种方法均获得高质量读段（平均Phred评分接近或超过30）。IGH转录本比例因方法而异：SMRT测序约0.6%，TRUST4-based ISRR约47%，RACE-RepSeq约75%。三种方法获得的可生产性IGH序列数（SMRT均值17,537；RACE-RepSeq均值105,627；ISRR均值20,578）和独特克隆型数（SMRT均值8,873；RACE-RepSeq均值19,950；ISRR均值5,350）处于相似数量级。SMRT和RACE-RepSeq的同种型分配能力较强（分别约95%和约100%），而ISRR仅约70%–80%的序列可确定同种型。IGHA、IGHG和IGHM的分布三者大致一致，但RACE-RepSeq人为夸大了IGHM占比。前50位最丰度克隆所占比例三者高度可比（SMRT 12.59%、RACE-RepSeq 11.89%、ISRR 11.43%）。Hill多样性曲线基本一致，ISRR在稀有克隆丰富度上略低。SHM分析中，RACE-RepSeq检测到的突变数最高（IgH每100碱基约5.42%），SMRT居中（3.91%），TRUST4最低（2.49%），但非同义突变/同义突变比率（NS/S ratio）三种方法相似（均值：SMRT 2.61，RACE-RepSeq 3.03，ISRR 2.46）。
*免疫组库整体参数：三种方法估算一致*
V/J基因使用模式高度相似，CDR3长度呈高斯分布且中位数为15–16个氨基酸，CDR3区理化性质（由Alakazam包计算）的雷达图三者几乎重叠。
*克隆检测：即使最频繁克隆也存在估算误差*
三种方法间克隆重叠率低（前100位克隆中仅4.5%–14.8%共享），这在高度多样化的正常B细胞组库中符合预期。但在前10位克隆分析中，即使以SMRT为参考，部分克隆仅被一种方法检测到，部分共享克隆的相对频率差异显著（可达约30倍），且ISRR中尤为突出。正交验证（靶向扩增加深测序）证实：RACE-RepSeq独有的5个高丰度克隆均被验证为高丰度（排名第1至第5位），而ISRR独有的5个高丰度克隆均未被验证为高丰度（排名第248至4529位，其中一个未能成功扩增）。
**五、讨论总结与研究结论**
讨论部分指出，尽管RACE-RepSeq和ISRR被广泛使用，但其局限性此前很少通过不依赖PCR扩增也不依赖预测性序列组装的独立参考标准进行实验评估。本研究利用PCR-independent SMRT测序作为参考，结果表明在全免疫组库层面，两种方法与SMRT测序高度一致，可在感染性疾病、疫苗接种和自身免疫等研究中提供可靠且可互换的全组库特性估计。然而在克隆级别，两种方法均存在偏差，RACE-RepSeq的定量准确性优于ISRR。ISRR在临床和回顾性研究中仍具有不可替代的价值，但应在明确其解释边界的前提下使用。
研究结论（翻译）：尽管样本量有限，本研究表明RACE-RepSeq和来自 bulk RNA-seq 的ISRR在评估IGH免疫组库整体特征时具有高度一致性和可靠性，即便以PCR-independent参考标准进行评价亦是如此。相比之下，克隆级别分析揭示了可影响单个克隆（包括高丰度克隆）鉴定和定量的方法学偏差。通过利用PCR-independent SMRT测序作为参考，本研究界定了广泛使用的RNA-based免疫组库分析策略各自的优势与局限，并为其在研究和临床场景中的合理应用提供了框架。然而，这些结论不应被过度推广，因为研究样本来源于Ig转录本丰度较高且易于获取的组织；在更复杂的生物学或临床环境中，方法选择可能受到更多限制，此时三种方法的整体一致性可能是最主要的信息。
