《Brain Sciences》：Resting-State 40 Hz EEG Activity Before and After Single-Session Non-Flickering 40 Hz Light Stimulation in Cognitively Normal Older Adults: An Uncontrolled Pilot Study
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背景：四十赫兹感觉刺激已成为一种调节与阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease, AD）相关神经活动的潜在方法。然而，非闪烁40 Hz光刺激后老年人的电生理变化尚不清楚。本研究探讨了单次非闪烁40 Hz光刺激干预是否与认知正常老年人静息态40 Hz
背景：四十赫兹感觉刺激已成为一种调节与阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease, AD）相关神经活动的潜在方法。然而，非闪烁40 Hz光刺激后老年人的电生理变化尚不清楚。本研究探讨了单次非闪烁40 Hz光刺激干预是否与认知正常老年人静息态40 Hz振荡增强相关。方法：在这项非对照单臂预试验中，16名认知正常老年人接受了60分钟的非闪烁40 Hz光刺激。在刺激前和刺激后立即记录静息态脑电图（electroencephalography, EEG）。使用单尾Wilcoxon符号秩检验并结合Benjamini–Hochberg错误发现率（false discovery rate, FDR）校正，对六个预定义头皮区域和全脑指标的38–42 Hz相对功率进行分析。10名参与者的刺激期间实时EEG探索性记录可用。结果：经FDR校正后，刺激后中央区（FDR = 0.045，效应量 = 0.555）和右颞区（FDR = 0.014，效应量 = 0.724）的静息态38–42 Hz相对功率升高。在绝对功率敏感性分析中，仅右颞区的增加在FDR校正后仍显著（FDR = 0.042）。刺激期间探索性分析显示右颞区38–42 Hz信噪比名义上增加（p = 0.026）。一名参与者报告了非常轻微的疲劳；未报告其他不良事件。结论：本预试验提示非闪烁40 Hz光刺激后静息态38–42 Hz活动出现区域性增强，绝对功率分析进一步支持右颞区的发现。鉴于非对照设计和较小样本量，这些发现仍属初步结果。
**一、研究背景与问题提出**
阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease, AD）是以老年人认知功能进行性衰退为特征的神经退行性疾病，其病理标志包括β-淀粉样蛋白（amyloid-beta, Aβ）异常沉积和磷酸化tau蛋白积聚，进而引发神经炎症、突触功能障碍和神经元丢失【1,2】。除经典病理特征外，AD还涉及线粒体稳态失调等多因素细胞内功能障碍，TDP-43共病理可能加剧线粒体功能障碍并增加疾病异质性【3】。在系统层面干预之外，基因编辑与基因组写入策略代表了新兴的分子水平治疗途径【4】。在此更广泛的治疗格局中，γ频段感觉刺激已成为一种潜在的非药物干预手段。既往动物研究表明，对小鼠连续7天每天给予1小时40 Hz（即γ频段）闪烁光刺激可显著减少视觉皮层Aβ沉积物的数量和面积，并改变小胶质细胞形态【5】；后续研究进一步显示40 Hz感觉刺激可减少海马和前额叶皮层Aβ负担并改善视觉空间记忆【6,7,8】。这些动物模型中的积极发现推动了在人类中验证类似获益的研究【9,10】。
目前已有若干干预研究将40 Hz视觉或视听刺激应用于老年人和轻度认知障碍或痴呆患者，以观察其对脑结构、功能、Aβ水平或认知结局的影响【11,12,13,14,15,16,17】。例如，Agger等人开展了一项随机双盲安慰剂对照试验，对11名轻至重度痴呆患者分别给予40 Hz白光刺激（不可见光谱闪烁）或连续非40 Hz光刺激，每日1小时持续6周，结果显示实验组认知功能出现接近显著的即时改善，且随访时海马体积更大、脑室体积更小【11】。麻省理工学院团队对15名轻度可能AD患者进行了为期3个月、每日1小时的40 Hz闪烁光加40 Hz声音刺激干预，发现40 Hz刺激组海马萎缩减少、默认网络和内侧视觉网络功能连接增强、面孔-姓名延迟回忆测试表现改善、日常活动节律性提升【12】。最近一项研究进一步表明，3个月的40 Hz非闪烁视觉刺激可减轻AD患者的神经精神症状和照顾者负担【17】。然而值得注意的是，这些人类研究均未使用电生理指标直接评估干预前后γ频段谱功率的变化。
从方法学角度看，大量观察性研究显示闪烁光相比非闪烁光能在刺激频率上诱发出更强的谱功率【18,19】。在干预试验中，部分研究团队使用40 Hz闪烁光【12,13,15,16】，另一些团队则开发了非闪烁（即不可见）40 Hz光技术【11,17】。非闪烁方法的优势在于受试者不会暴露于可见闪烁，舒适度更高。尽管采用非闪烁40 Hz刺激的研究已报道认知和神经精神症状方面的潜在改善【11,17】，但直接证明此类干预后40 Hz谱功率增加的电生理证据仍然缺乏。
为验证非闪烁40 Hz视觉刺激的可行性并评估其即时神经生理效应，本预试验采用单次干预设计，以最小化受试者负担、减少潜在安全性顾虑，并为评估γ频段活动的急性变化能否被可靠检测提供一个受控框架。动物和人类研究证据提示γ夹带可在刺激后即刻发生，支持了单次干预范式的合理性【20,21】。
**二、研究设计与方法概述**
本研究为一项非对照单臂前后测预试验分析，数据来自一项在ClinicalTrials.gov注册（NCT06715995）的随机对照试验，本文仅报告干预组的初步结果。研究经长庚纪念医院伦理委员会批准（No.: 202401421B0A3），所有受试者签署书面知情同意。共招募16名社区居住的健康老年人（12名女性；平均年龄70.56岁；平均受教育年限11.43年），入组标准包括年龄≥55岁、认知功能筛查量表（Cognitive Abilities Screening Instrument, CASI）得分在校正年龄和教育后处于正常范围、自我报告无严重神经或精神疾病、未服用影响认知功能的药物、视力正常或矫正正常。试验使用Aleddra公司定制设计的垂直LED光源，包含两个分别以80 Hz和120 Hz方波调制的光源，调制深度100%。由于两个载波频率均高于临界闪烁融合阈值（>60 Hz），个体高频调制不被感知为可见闪烁。该刺激范式旨在通过视觉系统内两个高频视觉输入的非线性处理产生40 Hz差频响应（120 ? 80 Hz = 40 Hz）【22】。EVERFINE LFA-3000光闪烁分析仪测量证实光源不直接发射可测量的40 Hz光学调制成分。刺激距离约100 cm，照度400 lux。EEG记录使用DSI-24干电极便携式头戴设备（WEARABLE Sensing Inc.），含19个按国际10–20系统排布的头皮电极及两个耳垂电极（A1、A2），采样率300 Hz【23】。静息态EEG在干预前后各记录5分钟（闭眼状态）。离线预处理使用EEGLAB，包括双侧耳垂重参考、高通滤波（0.1 Hz）、陷波滤波（60 Hz）、坏通道插值、分段（2 s）、±100 μV幅度判据和独立成分分析（ICA）去除伪迹。功率谱密度采用BrainVision Analyzer 2.3计算，以Hanning窗（窗长50%）进行快速傅里叶变换（FFT），频谱分辨率0.5 Hz。相对功率将各频率绝对功率归一化至1–100 Hz总功率，38–42 Hz相对功率取该范围内各频点相对功率的均值。六个预定义头皮区域为额区、中央区、顶区、左颞区、右颞区和枕区，另计算全脑指标。主要分析采用单尾Wilcoxon符号秩检验比较干预前后差异，并以Benjamini–Hochberg FDR法对七个指标进行多重比较校正。敏感性分析采用同样的统计框架评估38–42 Hz绝对功率变化。10名受试者进行了刺激期间实时EEG探索性记录，采用信噪比（signal-to-noise ratio, SNR）分析，信号定义为38–42 Hz平均谱功率，噪声定义为邻近两侧各1 Hz范围（37–38 Hz和42–43 Hz）的平均谱功率。不良事件在干预结束时通过标准化表格收集。效应量以r = |Z|/√N计算，Hodges–Lehmann（HL）估计值及95%置信区间用于量化变化幅度。
**三、主要研究结果**
预-后干预比较结果如图2所示。经多重比较校正后，静息态38–42 Hz相对功率在中央区（Z = 2.223, p = 0.013, FDR = 0.045, 效应量 = 0.555; HL估计 = 0.023, 95% CI [0.003, 0.045]）和右颞区（Z = 2.896, p = 0.002, FDR = 0.014, 效应量 = 0.724; HL估计 = 0.063, 95% CI [0.016, 0.118]）出现显著增加（见图3、表2）。左颞区（p = 0.024）和全脑指标（p = 0.039）存在名义上的增加，但未通过FDR校正。补充图S1展示了30–50 Hz频率范围的静息态EEG相对功率谱。
绝对功率敏感性分析显示，经FDR校正后仅右颞区38–42 Hz绝对功率显著增加（Z = 2.482, p = 0.006, FDR = 0.042, 效应量 = 0.620; HL估计 = 0.049, 95% CI [0.011, 0.108]）。中央区（p = 0.024）、顶区（p = 0.039）和左颞区（p = 0.028）仅有名义上的增加（补充表S1）。这为右颞区发现提供了更强的稳健性支持，同时提示对中央区结果应持更为谨慎的解读。
不良事件方面，16名受试者中仅1人（6.3%）报告在单次60分钟刺激后出现非常轻微的疲劳，无其他不良事件。
刺激期间实时EEG探索性分析（n = 10）：视觉检查显示刺激期间多个头皮区域在目标38–42 Hz频段出现谱特征突出（图4）。定量SNR分析显示刺激期间所有六个头皮区域及全脑指标的SNR值均出现描述性增高，其中右颞区的增加达到名义显著（刺激前：0.978 ± 0.016；刺激中：1.087 ± 0.044；Z = 1.988，单尾p = 0.026），其余比较未达到名义显著（补充表S2）。该探索性结果提示刺激期间部分头皮区域出现目标频率周围的谱特征增强，但尚不能确立普遍的神经夹带效应，也不能将观察到的信号与潜在的刺激相关伪迹区分开来。
**四、讨论与结论**
讨论部分指出，既往人类40 Hz感觉刺激研究主要关注灰质体积、白质完整性、fMRI功能连接、认知表现和神经精神症状等结局指标【11,12,13,14,15,17】，尚未有研究直接采用电生理指标评估刺激后静息态γ频段谱功率的变化。本研究首次提供了非闪烁40 Hz光刺激单次干预后认知正常老年人静息态38–42 Hz活动改变的初步EEG证据。关于单次60分钟干预是否足以诱导可测量的人脑神经变化，既有研究提供了支持：一项研究表明仅10分钟的40 Hz听觉刺激即可显著增加皮层脊髓兴奋性【21】；另一项fMRI研究报道仅5分钟的40 Hz经颅振动刺激即可增强自发脑活动（以低频波动振幅（ALFF）为指标）【20】。
关于结果的区域特异性解读，研究人员强调以下要点：已观察到经校正后显著增加的静息态38–42 Hz相对功率仅出现在中央区和右颞区，而枕区未检测到显著变化。右颞区结果在绝对功率敏感性分析中依然显著，排除了仅由归一化分母变化解释的可能性；中央区结果在绝对功率分析中未通过校正，应谨慎解读。鉴于样本量较小，枕区等区域的非显著性结果可能反映统计功效不足，不应被视为区域特异性的证据。此外，低密度头皮EEG无法定位皮层发生器，中央区和右颞区的发现应被解读为头皮层面变化而非相应皮层区域的优先参与，枕区效应的缺失也不表示视觉皮层未被涉及。闭眼静息态条件下显著的α活动可能影响整体频谱构成【26,27,28】，尽管38–42 Hz频段与常规α频段分离良好，但无法排除潜在的跨频率相互作用【29,30】。因此，刺激后38–42 Hz相对功率的增加应被解读为闭眼静息态频谱活动的改变，而非持续40 Hz视觉夹带的证据。
本研究的主要局限性包括：（1）非对照单臂前后测设计，无法将观察到的变化具体归因于40 Hz刺激本身，非特异性光暴露、对话参与程度、注视方向和有效视觉暴露的差异、时间推移、警觉性或唤醒度变化、重复EEG评估等因素均可能造成影响；正在进行的随机对照试验设有接受替代频率非闪烁光刺激的活性对照组，将可直接进行组间比较。（2）单次干预设计和相对较小的样本量限制了结果的普适性和检测较小前后差异的统计功效，个别头皮区域的非显著性结果不应被视为无神经生理改变的证据，也不能确立区域特异性。（3）未进行源定位分析，头皮层面变化对应的精确神经发生器尚不确定；未进行专用肌电（EMG）记录，尽管在预处理中应用了基于ICA的伪迹去除，残留的肌源性污染（尤其在靠近颞肌的颞区电极）无法完全排除。刺激期间实时EEG中观察到的38–42 Hz频谱突出也不能被明确归因于神经夹带或与潜在的刺激相关伪迹区分。（4）虽然在数据采集前电极阻抗维持在1 MΩ以下，但未在记录过程中持续监测，与电极-头皮接触或阻抗变化相关的记录变异性无法完全排除。（5）研究仅关注静息态EEG，未评估前后行为或认知结局，限制了对电生理变化是否与功能获益相关的判断。
**研究结论**：本预试验EEG研究提供了初步证据，表明认知正常老年人单次非闪烁40 Hz光刺激后静息态38–42 Hz活动出现区域性增加，其中右颞区发现获得了绝对功率敏感性分析的额外支持。该刺激方案耐受性良好，支持这种非闪烁方法的可行性。然而，由于缺乏同步对照组，观察到的前后变化不能具体归因于40 Hz刺激。这些发现为后续开展对照研究以考察所观察电生理变化的重现性、频率特异性和功能相关性提供了基础。
