Cry4Aa毒素与N-乙酰半乳糖胺基团的互作促进其孔道形成并增强杀蚊毒力

《Applied and Environmental Microbiology》：Interaction with the N-acetylgalactosamine moiety facilitates pore formation by Cry4Aa toxin, thereby increasing its toxicity

　　

摘要专业翻译 Cry4Aa是由苏云金芽孢杆菌以色列亚种（Bacillus thuringiensis serovar israelensis）产生的杀蚊幼虫毒素。Cry4Aa具有包含三个结构域（I、II和III）的特征性架构，并作为孔道形成毒素（pore-forming toxin）发挥功能，这与许多已报道的杀虫Cry毒素一致。然而，Cry4Aa在孔道形成之前的事件机制，包括受体识别，仍有待阐明。本研究考察了糖基部分在Cry4Aa作用模式中的潜在参与，特别关注孔道形成过程。Cry4Aa与糖N-乙酰半乳糖胺（N-acetylgalactosamine，GalNAc）表现出显著增强的结合亲和力。此外，N-乙酰半乳糖胺处理显著增强了Cry4Aa对淡色库蚊（Culex pipiens）蚊幼虫的毒力。在N-乙酰半乳糖胺存在下，Cry4Aa与磷脂酰胆碱（phosphatidylcholine，PC）脂质体的结合增加了1.4倍。该糖的存在不影响Cry4Aa在人工脂双层中形成的孔道的单通道电导，但似乎增加了指定面积内Cry4Aa孔道的数量。In silico分子对接分析揭示了位于Cry4Aa各结构域环绕形成的空腔内的潜在结合位点。这些结果表明，Cry4Aa与N-乙酰半乳糖胺基团的互作是孔道形成过程中的关键步骤。该互作可能诱导Cry4Aa分子发生构象变化，从而促进其插入靶膜。

论文解读

一、研究背景与科学问题

苏云金芽孢杆菌以色列亚种（Bacillus thuringiensis serovar israelensis，Bti）是一种革兰氏阳性产孢细菌，对包括伊蚊属（Aedes）、按蚊属（Anopheles）和库蚊属（Culex）在内的多种医学重要蚊虫幼虫具有强毒力，长期以来被用作蚊虫控制剂。Bti的杀蚊幼虫活性来源于三种Cry毒素（Cry4Aa、Cry4Ba和Cry11Aa）以及Cyt1Aa毒素。这些毒素主要以无活性的原毒素形式合成于伴孢晶体中，当被易感蚊幼虫摄入后，晶体在肠道碱性环境中溶解，随后经肠道蛋白酶加工产生活性毒素。

根据胶体渗透裂解模型，活性毒素在与特异性受体发生复杂互作后形成孔道，允许离子和水分子进入靶细胞，破坏膜电位，导致细胞肿胀并最终裂解死亡。X射线晶体学研究表明，Cry4Aa、Cry4Ba和Cry11Aa具有相似的三结构域架构：N端结构域I由七个α-螺旋束组成，被认为形成跨膜孔道；中央结构域II由三个反向平行β-折叠片组成，作为受体结合结构域；C端结构域III由反向平行β-折叠形成β-三明治折叠。然而，Cry4Aa在孔道形成之前的受体识别机制尚未完全阐明。值得注意的是，Cry4Aa结构域II环区的氨基酸残基替换并未显著降低其杀蚊幼虫活性，提示Cry4Aa的受体结合可能涉及分布于结构域II和/或III中的多个协同作用的亚位点。

此外，Cry4Aa结构域III与一些碳水化合物结合蛋白在结构上具有相似性，如纤维单胞菌（Cellulomonas fimi）的纤维素结合结构域和热纤梭菌（Clostridium thermocellum）木聚糖酶，这提示糖基部分可能在Cry4Aa与其受体结合中发挥作用。已有研究报道，鳞翅目特异性毒素Cry1Ac通过结构域III识别N-乙酰半乳糖胺（GalNAc）基团并结合其受体氨肽酶N（APN）。基于上述背景，研究人员开展了本研究，旨在考察糖基部分在Cry4Aa作用模式中的潜在参与，特别聚焦于孔道形成过程。

二、研究内容与主要结论

本研究系统考察了Cry4Aa与五种糖（GalNAc、GlcNAc、半乳糖、甘露糖和岩藻糖）之间的结合亲和力，评估了这些糖对Cry4Aa杀蚊幼虫活性的影响，并通过电生理学手段分析了糖处理对Cry4Aa孔道形成的影响，最后利用分子对接分析预测了Cry4Aa分子表面的潜在GalNAc结合位点。研究得出以下主要结论：Cry4Aa对GalNAc表现出显著高于其他糖的结合亲和力；GalNAc处理显著增强了Cry4Aa对淡色库蚊幼虫的毒力；GalNAc处理增加了Cry4Aa与磷脂酰胆碱脂质体的结合并增加了指定面积内孔道的数量，但不影响单通道电导；分子对接分析在Cry4Aa三个结构域环绕形成的空腔中鉴定出两个最有前景的GalNAc结合位点（C1和C2）。

三、主要关键技术方法

研究人员使用了以下关键技术方法：石英晶体微天平（quartz crystal microbalance，QCM）技术用于测定Cry4Aa与各糖之间的结合亲和力（解离常数K_D）；以淡色库蚊三龄幼虫为对象的生物测定法用于评估糖处理对Cry4Aa杀蚊幼虫毒力的影响（LC₅₀值通过PROBIT分析确定）；基于磁珠的磷脂酰胆碱脂质体结合实验结合斑点印迹（dot blot）检测用于分析GalNAc处理对Cry4Aa膜结合能力的影响；琼脂糖凝胶支撑脂双层电生理学记录技术用于分析Cry4Aa孔道的单通道电导和孔道数量；CB-Dock2服务器的蛋白-配体盲对接工具用于预测Cry4Aa、Cry4Ba和Cry11Aa分子表面的潜在GalNAc结合位点。

四、研究结果

重组Cry4Aa的制备。 研究人员成功表达并纯化了重组Cry4Aa。SDS-PAGE分析显示，GST-Cry4Aa融合蛋白（约100 kDa）和经凝血酶切割后的Cry4Aa活性毒素片段（约70 kDa）均达到高度纯化。

Cry4Aa与多种糖之间的互作。 通过QCM技术分析Cry4Aa与五种糖的结合亲和力，发现Cry4Aa对GalNAc表现出显著最高的结合亲和力，K_D值为8 ± 3 μM；其次是GlcNAc，K_D值为231 ± 104 μM；半乳糖、甘露糖和岩藻糖的结合亲和力较低，K_D值均大于2 mM。

糖处理对Cry4Aa杀蚊幼虫活性的影响。 以淡色库蚊幼虫进行生物测定，未经糖处理的GST-Cry4Aa的LC₅₀值为1.15 μg/mL。经GalNAc处理后，LC₅₀值降至0.36 μg/mL，毒力提高三倍以上。GlcNAc处理组的LC₅₀值为0.95 μg/mL，毒力略有提高。半乳糖、甘露糖和岩藻糖处理组的毒力与未处理组相当，LC₅₀值分别为1.21、1.44和1.27 μg/mL。单独给予GST（无论是否经糖处理）在测试浓度范围内未检测到杀蚊幼虫活性。

GalNAc处理对Cry4Aa膜结合的影响。 将活性Cry4Aa毒素与PC脂质体共孵育后通过斑点印迹检测，发现尽管PC脂质体中不存在Cry4Aa受体，仍可检测到微弱但可辨别的结合信号。GalNAc预处理使Cry4Aa与PC脂质体的结合量增加了1.4倍。

GalNAc处理对Cry4Aa孔道形成的影响。 电生理学分析显示，在对称的150 mM KCl缓冲液中，Cry4Aa孔道的单通道电导为188.1 ± 32.3 pS，与既往报道的约187 pS一致。在含有5 mM GalNAc的溶液中，单通道电导为195.0 ± 15.1 pS，表明GalNAc处理不影响Cry4Aa孔道的大小。然而，GalNAc处理增加了指定面积内Cry4Aa孔道的平均数量：在1.0、1.5和2.5 μg/mL毒素浓度下，未处理组的孔道数分别为1.33、1.40和1.73个，而GalNAc处理组分别为1.60、1.73和2.33个。

分子对接分析。 利用CB-Dock2服务器进行蛋白-配体盲对接分析，在Cry4Aa分子中鉴定出两个最有前景的GalNAc结合位点：空腔C1由结构域I的R²⁹⁶、结构域II的T³²⁷RE、Y³³¹、R³⁵⁵RPH、F³⁶⁰以及结构域III的Q⁵⁵⁷G和G⁵⁶⁴D组成，空腔体积为1,820 ?³，GalNAc结合的Vina评分为?6.6 kcal/mol；空腔C2位于C1的相对侧，由结构域I的G⁷⁸T和L⁸¹T、结构域II的Q³²³SE和L⁴⁷⁹以及结构域III的S⁵²⁵SVD和Y⁵³⁴组成，空腔体积为1,786 ?³，Vina评分为?5.1 kcal/mol。在Cry4Ba中也鉴定出一个与Cry4Aa空腔C1和C2类似的GalNAc结合位点（Vina评分为?6.4 kcal/mol），在Cry11Aa中鉴定出的最有望结合位点的Vina评分为?6.7 kcal/mol。

五、讨论与结论

本研究的发现表明，Cry4Aa与GalNAc基团的互作在其作用模式中发挥重要作用。与Cry1Ac中GalNAc结合抑制毒素毒力不同，GalNAc结合增强了Cry4Aa的毒力，这种差异可能源于两种毒素分子中GalNAc结合位点的位置不同。在Cry4Aa中，预测的结合位点位于三个结构域之间的空腔而非结构域III内部，这提示GalNAc结合可能诱导Cry4Aa分子发生构象变化，从而促进其膜插入和孔道形成。在公认的孔道形成模型中，与受体上GalNAc基团的互作可能是孔道形成之前的最终步骤之一，该互作诱导的构象变化有助于结构域I的α-螺旋插入膜中。此外，GalNAc处理还可能促进Cry4Aa穿过蚊幼虫围食膜（peritrophic membrane，PM）。未来的研究需要利用Aedes和Anopheles幼虫考察糖基部分对杀蚊活性的影响，并通过定点突变实验验证预测的GalNAc结合位点的功能意义。

研究结论。 本研究表明，杀蚊幼虫毒素Cry4Aa对GalNAc具有选择性结合亲和力，从而增强其对淡色库蚊的杀蚊 efficacy。研究数据表明，GalNAc促进与膜插入和孔道形成相关的步骤，而非改变孔道电导。计算分析在Cry4Aa结构中鉴定出候选的GalNAc结合空腔，但这些空腔的功能作用仍需在未来通过实验验证。